Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme
Summary
Bu makale, flow sitometri kullanarak sabit ve canlı hücrelerin calpain aktivitesini ölçmek için ayrıntılı protokol.
Abstract
Calpains her yerde hücre içi kalsiyum duyarlı, nötr sistein proteazlar<sup> 1</sup>. Calpains sinyalizasyon, sitoskeletal yeniden şekillenme, gen ekspresyonu, apoptozis düzenlenmesi ve hücre döngüsünün ilerlemesi de dahil olmak üzere birçok fizyolojik süreçleri, önemli rol oynarlar<sup> 1</sup>. Calpains kas distrofiler, kanser, diyabet, Alzheimer hastalığı ve multipl skleroz gibi birçok patolojiler suçlanmıştır<sup> 1</sup>. Calpain yönetmelik karmaşık ve tam olarak anlaşılamamıştır. mRNA ve protein düzeyleri calpain aktivitesini ölçmek için gen veya protein anlatım tekniklerinin kullanımı sınırlayıcı, aktivite ile zayıf ilişkilidir. Bu video protokol detayları calpain aktivitesini ölçmek için sabit ve canlı hücrelerin laboratuvar, bir akım sitometrik tahlil gelişti. Bu yöntem, calpain özellikle bölünmüş floresan substrat BOC-LM-CMAC, calpain aktivitesini ölçmek için kullanır.<sup> 2</sup> Bu video, sabit ve yaşayan bir fare 32Dkit lösemi hücrelerinin, tek başına veya bir splenocyte nüfusun bir parçası olarak faaliyet calpain bir LSRII (BD Bioscience) ile ölçülür. 32Dkit hücrelerin artmış aktivite normal dalak olduğu gösterilmiştir.
Protocol
Discussion
Bu video protokolü sabit ve yaşam 32Dkit hücrelerinde calpain aktivite tespit edilmiştir. Calpain inhibitörü PD150606 ile hücre hattı Tedavi, hücrelerin calpain aktivitesinin inhibisyonu ile sonuçlandı. Buna ek olarak, MEK1 inhibitörü PD98059 tedavisi, hücrelerin calpain aktivitesinin inhibisyonu ile sonuçlandı. ERK calpain-2 (3) büyük bir aktivatör. Bu sonuçlar calpain-2 aktivitesinin 32Dkit hücreleri baskın olduğunu düşündürmektedir. Laboratuvarımızda Şu çalışmalar artmış …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kanada Sağlık Araştırma, Lösemi ve Lenfoma Derneği Kanada ve Kanada Lenfoma Vakfı Enstitüleri hibe ile desteklenir.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
Referenzen
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
