在固定和活细胞，流式细胞仪测量钙蛋白酶活性
Summary
本文将详细测量固定和生活用流式细胞仪检测细胞中的蛋白酶活动的协议。
Abstract
钙蛋白酶是无处不在的细胞内钙敏感，中性半胱氨酸蛋白酶<sup> 1</sup>。钙蛋白酶发挥至关重要的作用，在许多生理过程，包括信号，细胞骨架重构，调节基因表达，细胞凋亡和细胞周期进程<sup> 1</sup>。钙蛋白酶有牵连的许多病症，包括肌营养不良症，癌症，糖尿病，阿尔茨海默氏症和多发性硬化症<sup> 1</sup>。钙蛋白酶调节是复杂的，完全了解。 mRNA和蛋白水平与活动相关的不良的限制措施蛋白酶活性基因或蛋白质表达技术的使用。此视频协议的细节在我们的测量在固定和活细胞的钙蛋白酶活性的实验室开发一个流式细胞仪测定。此方法使用中银LM – CMAC的荧光底物，这是由蛋白酶裂解，来衡量蛋白酶的活动。<sup> 2</sup>在这个视频中，蛋白酶活动是在固定和生活的小鼠32Dkit白血病细胞，单独或作为一个人口脾的一部分使用LSRII（BD生物科学）。 32Dkit细胞有升高的活动相比，正常脾。
Protocol
准备试剂注：所有PBS含有的Ca 2 +和Mg 2 + 检测试剂 20μM7 – 氨基-4 – 氯甲基香豆素，T – BOC -亮氨酸，蛋氨酸酰胺（BOC – LM – CMAC）添加至室温，PBS。每个细胞悬液，将需要2ML的检测试剂。 1％多聚甲醛（定格） 稀4％多聚甲醛在室温PBS原液。每个流式细胞仪管分装1ml含1％多聚甲醛。流式细胞仪三管为每个实验条件的要求（如32Dkit，32Dkit + PD1506…
Discussion
在固定和生活32Dkit细胞的钙蛋白酶活动已确定在这个视频协议。导致完全抑制蛋白酶的活性，在细胞治疗的细胞株的蛋白酶抑制剂PD150606。此外，治疗与MEK1抑制剂PD98059完全抑制蛋白酶的活性，在细胞内。 ERK的是主要激活的钙蛋白酶2 3。这些结果表明，钙蛋白酶2的活动主要是在32Dkit细胞。在我们的实验室目前的工作是调查蛋白酶的活性增加造成的后果和蛋白酶- 1 – 2蛋白酶在白血病的贡献?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
由加拿大健康研究，白血病和淋巴瘤协会加拿大和加拿大淋巴瘤基金会机构的拨款支持。
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
Referenzen
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
Tags
Calpain ActivityFlow CytometryFixed CellsLiving CellsCalcium-sensitive ProteasesPhysiological ProcessesSignalingCytoskeletal RemodelingGene Expression RegulationApoptosisCell Cycle ProgressionPathologiesMuscular DystrophiesCancerDiabetesAlzheimer’s DiseaseMultiple SclerosisCalpain RegulationMRNA LevelsProtein LevelsGene Expression TechniquesFluorescent Substrate BOC-LM-CMACCalpain Activity MeasurementMurine 32Dkit Leukemia CellsSplenocyte Population
Diesen Artikel zitieren
Farr, C., Berger, S. Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (41), e2050, doi:10.3791/2050 (2010).