ベイカーにおけるミトコンドリア形質転換

酵母Saccharomyces cerevisiaeは、ミトコンドリアの生合成の研究に使用される広く認識されているモデルです。酵母は嫌気性の通性生物であるため、呼吸を損なう突然変異を導入する原因と結果を広範囲に研究することが可能です。さらに、この生物は、ミトコンドリア経路を研究するための友好的な遺伝的および生化学的ツールを持っています。しかし、呼吸複合体の集合とミトコンドリアタンパク質合成のメカニズムを探求するための最も強力なリソースの1つは、ミトコンドリアを変換し、細胞小器官のゲノムを改変する能力です。これまで、ミトコンドリアDNA(mtDNA)に点変異または小さな欠失/挿入1,2,3,4,5を導入し、遺伝子を欠失^6,7し、遺伝子再配列^7,8を行い、ミトコンドリアタンパク質^9,10にエピトープを付加し、核からミトコンドリア¹¹に遺伝子を再配置することが有用であった。^図12に示すように、BarStar¹³、GFP^14,15、ルシフェラーゼ¹⁶、および最も広く使用されているARG8^m17,18などのレポーター遺伝子を導入します。ミトコンドリアのゲノム改変により、これまで理解するのが難しかったメカニズムを解剖し、特定することが可能になりました。例えば、ミトコンドリアDNAのCOX1遺伝子座に挿入されたARG8^mレポーター遺伝子は、Mss51がCox1の生合成に二重の役割を果たしていることを理解する上で極めて重要でした。第一に、それはCOX1 mRNAの翻訳活性化因子であり、第二に、新しく作られたCox1タンパク質^7,19のアセンブリシャペロンです。この研究は、S. cerevisiaeミトコンドリアを形質転換するための詳細な方法を提示しています。ミトコンドリア形質転換プロトコルは16,20,21,22,23以前に発表されましたが、方法のさまざまな段階と詳細を完全に理解するには、ビデオによる視覚的なアプローチが不可欠です。この方法はさまざまなステップで構成され、次の 4 つの一般的な段階に分かれています。

図1:高速微小発射体衝撃によるミトコンドリア形質転換手順の概要:1)タングステン粒子はDNAコーティングの前に滅菌および調製されます。2)WPの表面に2つの異なるプラスミドが沈殿します。1つは、ミトコンドリアマトリックスに向けられるコンストラクトを含む細菌プラスミドです。もう1つは、補助栄養マーカーを担ぐ核酵母発現ベクターです。3)ミトコンドリアDNA(rho⁰)を欠く受容体酵母株は、ガラクトースやラフィノースのような発酵性炭素源で増殖し、ミトコンドリア遺伝子発現のグルコース抑制を一切及ぼさない^34,35。培養物は、砲撃媒体を含むシャーレに広げられます。4)プラスミドでコーティングされたWPは、高速微小発射体衝撃によって受容体株に撃ち込まれます。5)ミトコンドリアプラスミドを含有する陽性合成rho^–コロニーは、テスター株と交配することによって選択される。6)ミトコンドリア構築物は、サイトダクションとして知られるプロセスによって合成rho^–株(ドナー)とアクセプター株と交配することにより、所望の遺伝子座でミトコンドリアゲノムに統合される。7)正の受容体であるミトコンドリア構築物を運ぶ一倍体株を選択し、異なる培地で精製します。略語:WPs =タングステン粒子;mtDNA = ミトコンドリアDNA。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ミトコンドリアゲノムへの組み込みを目的としたDNAコンストラクトによる細胞の形質転換 (図1、ステップ1-4)
完全なミトコンドリアゲノム(rho⁺)を含む酵母を直接形質転換することは可能ですが、細胞がミトコンドリアDNA(rho⁰)を欠いている場合、形質転換は10〜20倍効率的です²⁴。タングステン粒子(WP)は、共形質転換される2つの異なるプラスミドでコーティングされています。第1のものは、 LEU2 または URA3 (例えば、それぞれYEp351またはYEp352)などの補助栄養マーカーを運ぶ酵母2 μ発現ベクターである。酵母細胞へのDNAの生物学的導入が成功すると、形質転換体は補助栄養培地(すなわち、ロイシンまたはウラシルを欠く培地)で増殖します。このプラスミドは、核プラスミドを獲得した細胞を最初に選択するのに役立ちます。そうしないと、結果として生じるコロニーの数がプレートを飽和させます。第2のプラスミドは、ミトコンドリアゲノムに組み込まれることを意図したミトコンドリア構造を含む細菌プラスミド(pBluescriptなど)である。コンストラクトは、目的のミトコンドリア領域と組換えするために、少なくとも100 ntの5’および3’に隣接するミトコンドリア配列を含まなければならない。私たちの経験では、より大きな隣接配列は、ミトコンドリアゲノムの標的遺伝子座とうまく組み換える可能性が高くなります。

具体的な例を図2²⁵に示す。この例では、対応するタンパク質(Cox1ΔC15)の最後の15アミノ酸をコードするミトコンドリアCOX1遺伝子の領域を削除することを目的としていました(図2A)。COX1ΔC15変異を持つ細菌プラスミドには、遺伝子の5’および3’の非翻訳領域がそれぞれ395 ntおよび990 nt含まれていました。プラスミドはpBluescript(pXPM61)から導き出され、2 μプラスミドYEp352とともに、WPの表面で共沈しました(図2B)。次に、WPをマイクロ発射体爆撃によって選択した受信者株に導入しました(図2C)。NAB69²⁶と名付けられたこの株は、kar1-1およびade2対立遺伝子を持つMATa、rho⁰株です(これらの特性の重要性については後述します)。細胞をウラシルを欠く衝撃培地に播種して、2 μプラスミドを獲得した細胞を選択しました(図2C)。細胞を30°Cで5〜7晩増殖させました。

ミトコンドリアコンストラクトを含む細菌プラスミドと補助栄養マーカーを保有する核2 μプラスミドを獲得した細胞の選択 (図1、 ステップ5)
陽性のコロニーは、ミトコンドリア²²に細菌プラスミドの多くのコピーを維持します。形質転換細胞はもともとrho⁰であるため、プラスミド中に存在するミトコンドリア構築物の翻訳を支持するミトコンドリア配列はありません。したがって、形質転換されたミトコンドリア遺伝子は発現しません。ミトコンドリアプラスミドを獲得した酵母コロニーを検出するために、形質転換体をテスター株と交配させる必要があります。テスター株のミトコンドリアゲノムには、目的の遺伝子の非機能的な変異型が含まれています。交配後、ミトコンドリアは融合し、形質転換プラスミドに含まれるミトコンドリア配列は、テスター株の変異したミトコンドリア遺伝子と再結合します。その結果、WT遺伝子の回復は機能を再構成します。結果として生じる二倍体は、検出可能な陽性の表現型(通常、呼吸培地またはアルギニンを欠く培地で成長する能力)を持ちます。ミトコンドリアで細菌プラスミドを運ぶ陽性細胞は、「合成rho^細胞」と呼ばれます。図2Dの具体例では、COX1ΔC15コンストラクト(XPM199と命名)を有する^{合成rho細胞}を、ウラシルを欠く培地(これは陽性コロニーを精製したマスタープレート)上にレプリカプレーティングした。また、非機能的な変異cox1D369Nを含むテスター株L45²⁷芝生にレプリカメッキされました。2晩交配した後、L45とXPM199のミトコンドリアゲノムが再結合し、機能的なCOX1遺伝子が生まれました。したがって、二倍体は呼吸器媒体上で成長する能力を回復しました。マスタープレートから、ポジティブコロニーを選びました。それらはウラシルを欠くプレート上に縞模様にされ、選択的試験を繰り返して純粋な^{合成rho細胞}を得ました(図2E)。テストプレートは合成rho^–コロニーの同定のみを目的としており、これらのプレートから突然変異体を回収することはできません。

意図した菌株のミトコンドリアゲノムへのコンストラクトの統合
このステップは、サイトダクション^28,29と呼ばれるプロセスによって達成される(図1、ステップ6)。このアプローチでは、合成rho^–ひずみ(ドナーひずみ)は、反対の嵌合タイプの意図されたアクセプターひずみと交配されます。本質的な要件は、2つの交配株のうち少なくとも1つが、核融合³⁰を妨げるkar1-1変異を有することである。したがって、2つの細胞を交配させると、二核受精卵が生成されます(図3)。親細胞(ドナーとアクセプター)からのミトコンドリアネットワークが融合し、ミトコンドリアDNA分子が再結合します。二核受精卵は、出芽を可能にするためにインキュベート/回収され、一倍体細胞が産生されます。これらの一倍体は、親細胞の1つの核背景を持っています。同様に、一倍体は、親細胞または目的の再結合ミトコンドリアDNAのいずれかからミトコンドリアDNAを運ぶことができます。しかし、kar1-1変異は100%有効ではなく、交配中にいくつかの真の二倍体が形成されます^28,29。合成rho^–株(ドナー、XPM199)は、例でkar1-1対立遺伝子を運びました。選択的マーカーとして、ade2対立遺伝子を有し、アデニンの補助栄養剤となりました(図4)。アクセプター株はXPM10であり、cox1Δ::ARG8^mコンストラクトを持つrho⁺株であり、レポーターARG8^mがミトコンドリアゲノム⁷のCOX1コドンを置き換えました。両方の細胞培養物の混合物をYPDプレートに滴として加え、交配を可能にしました。3〜5時間後、細胞を光学顕微鏡で観察し、交配に関連する細胞形状であるshmoos(図3B)の形成を検出しました。インキュベーション/回復時間の後、二核受精卵をアデニンを欠く培地に播種して、ドナー細胞の増殖を防いだ。

目的のミトコンドリアゲノムを運ぶ一倍体株の選択 (図1、ステップ7)
ドナー細胞、アクセプター細胞、および二倍体細胞の混合物が細胞導入後に存在します。したがって、二核受精卵のインキュベーション/回収後、目的の半数体を同定および精製するために、細胞を異なる選択培地で増殖させる必要があります。選択培地は、ドナーの遺伝子型、アクセプター株、および意図されるミトコンドリア構造に依存します。しかし、一般的に、選択培地を選択する理由は、i)インキュベーション/回収後、サイトダクションミックスは、ドナーの親株が増殖できない選択培地で増殖する。図4A、Bの具体例では、ドナー(合成rho^–株)は非機能的なade2対立遺伝子を運ぶ。したがって、サイトダクションミックスは、アデニンを欠く培地プレート上でインキュベートする必要があります。これがマスタープレートです。ii)コロニーが成長すると、マスタープレートはアデニンを欠く培地で再び複製され(目的の陽性コロニーが精製される新しいマスタープレートを生成するため)、次に、二倍体のみが成長できる培地で複製されます。これは、二倍体コロニーのさらなる不注意な精製を避けるために必要です。図 4C の例の場合、ロイシンが不足している媒体で成長できるのは二倍体のみです。iii)マスタープレートは、目的のミトコンドリアDNAを組み込んだアクセプター一倍体のみが増殖する培地でも複製されます。図4Cの例では、Cox1ΔC15タンパク質が機能しているため、炭素源としてエタノール/グリセロールを含む呼吸器培地で一倍体が成長します。得られた、目的のmtDNAを持つrho⁺株は、XPM209²⁵と命名されました。 図2および図4で使用した株を表1に示します。

図2:ミトコンドリアの形質転換と陽性のrho^–細胞の選択の具体例を説明する図。 (A)ミトコンドリアゲノムの意図された改変は、Cox1サブユニット(Cox1ΔC15)の最後の15アミノ酸をコードする領域の欠失であった。(B)WPを2つのプラスミドでコーティングして、酵母細胞を形質転換しました。1つは、核内で指向性および発現した2 μプラスミドYep352でした。もう1つはプラスミドpXPM61で、これにはCOX1ΔC15対立遺伝子に加えて、COX1 5’および3′-UTRの395 ntおよび990 ntがそれぞれ含まれています。(C)WPは、ミトコンドリアDNAを欠くNAB69株(rho0株)の細胞に導入された。爆撃プレートから得られた形質転換コロニーは、核プラスミドYEp352の補助栄養マーカーであるウラシルを欠く培地で再現されました。(D)陽性のrho^–コロニーを選択するために、-URAプレートをウラシルを欠く培地上に複製した。これは、ポジティブコロニーを選別して分離するためのマスタープレートでした。また、リッチメディア(YPD)およびテスター株の芝生を有するプレート上でも複製された。交配中に、合成ロ^ミトコンドリアDNAは、COX1遺伝子(D369N)に変異を持つテスター株L45²⁷由来のミトコンドリアDNAと組み換えられた。呼吸器媒体上で成長した二倍体には、形質転換されたDNAが含まれていました。対応するコロニーをマスタープレートから選択して、レストリークと精製を行いました。すべてのレプリカメッキ全体でマスタープレートの陽性コロニーを識別するために、プレートの端に油性マーカーでマークが付けられました(緑の線)。(E)選択された陽性コロニーは、ウラシルを欠く培地で再調整されました。これが新しいマスタープレートです。Dと同様に、合成rho^–コロニーを精製するためにさらに2回の試験が実施された。略語:WPs =タングステン粒子;mtDNA = ミトコンドリアDNA;-URA / Sorb =ウラシルが不足している/ソルビトールを含む;WT = 野生型。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:サイトダクション手順を説明する図。 (A)細胞導入中の細胞の交配方法の一般的な概要。サイトダクションでは、ドナー株とアクセプター株のミトコンドリアが融合し、両株のミトコンドリアDNAが再結合します。 kar1-1 変異³⁰により核融合が減少するため、二核接合子が形成される。ある程度のインキュベーション/回復時間の後、意図されたミトコンドリア変異を含む二核受精卵の芽と一倍体受容体が選択されます。(B)合成rho^– 株(ドナー)とアクセプター株のサイトダクションによる交配により、交配酵母の特徴的な形状であるshmoos(赤い矢印)の形成が可能になります。画像は、100倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡で撮影されました。スケールバー = 10 μm. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4:ミトコンドリアゲノムに突然変異COX1ΔC15を組み込むための細胞導入の具体例を説明する図(A)合成rho^株(ドナー、XPM199)と目的株(アクセプター、XPM10)の液体培養物を混合して交配させた。shmoo形成後、混合物を液体培養物中で2〜4時間回収した。次に、サイトダクションミックスをアデニンを欠く培地でプレート上に広げ、ドナー細胞の増殖を防いだ。(B)サイトダクション中のドナー(XPM199)とアクセプター(XPM10)からのミトコンドリアDNAの組換えイベントの概略図。(C)マスタープレートを異なる選択培地で複製し、オルガネラのDNA(XPM209)に意図されたミトコンドリア遺伝子を統合した一倍体を同定し精製した(XPM209)²⁵。略語:-ADE =アデニンが不足している。-LEU = ロイシンが不足している。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。