Transformación mitocondrial en Baker

La levadura Saccharomyces cerevisiae es un modelo ampliamente reconocido que se utiliza para estudiar la biogénesis mitocondrial. Dado que la levadura es un organismo anaeróbico y facultativo, es posible estudiar ampliamente las causas y consecuencias de la introducción de mutaciones que perjudican la respiración. Además, este organismo posee herramientas genéticas y bioquímicas amigables para estudiar las vías mitocondriales. Sin embargo, uno de los recursos más poderosos para explorar los mecanismos de ensamblaje del complejo respiratorio y la síntesis de proteínas mitocondriales es la capacidad de transformar las mitocondrias y modificar el genoma del orgánulo. Anteriormente, ha sido útil introducir en el ADN mitocondrial (ADNmt) mutaciones puntuales o pequeñas deleciones/inserciones ^1,2,3,4,5, eliminar genes ^6,7, hacer reordenamientos genéticos ^7,8, agregar epítopos a las proteínas mitocondriales ^9,10, reubicar genes del núcleo a las mitocondrias^11,12, e introducir genes reporteros como BarStar¹³, GFP^14,15, luciferasa¹⁶ y el ARG8^m17,18 más utilizado. Las modificaciones del genoma mitocondrial nos han permitido diseccionar e identificar mecanismos que de otro modo habrían sido difíciles de comprender. Por ejemplo, el gen reportero ARG8^m insertado en el locus COX1 en el ADN mitocondrial fue crucial para comprender que Mss51 tiene un doble papel en la biogénesis de Cox1. En primer lugar, es un activador traduccional del ARNm de COX1 y, en segundo lugar, es una chaperona de ensamblaje para la proteína Cox1 ^7,19 recién creada. En este trabajo se presenta un método detallado para transformar las mitocondrias de S. cerevisiae. A pesar de que el protocolo de transformación mitocondrial fue publicado anteriormente 16,20,21,22,23, un abordaje visual a través de un video es esencial para comprender a fondo las diferentes etapas y detalles del método. El método consta de varios pasos y se divide en cuatro etapas generales:

Figura 1: Descripción general del procedimiento de transformación mitocondrial por bombardeo de microproyectiles a alta velocidad: 1) Las partículas de tungsteno se esterilizan y preparan antes del recubrimiento del ADN. 2) Dos plásmidos diferentes se precipitan en la superficie de los WPs. Uno es un plásmido bacteriano que contiene la construcción que se dirigirá a la matriz mitocondrial. El otro es un vector de expresión de levadura nuclear portador de un marcador de auxotrofia. 3) Una cepa de levadura receptora que carece de ADN mitocondrial (rho⁰) se cultiva en una fuente de carbono fermentativo como la galactosa o la rafinosa, que no ejerce ninguna represión de la glucosa en la expresión génica mitocondrial^34,35. El cultivo se propaga en placas de Petri que contienen el medio de bombardeo. 4) Los WP recubiertos con plásmidos son disparados a la cepa receptora mediante un bombardeo de microproyectiles de alta velocidad. 5) Las colonias de rho^– colonies sintéticas positivas que contienen el plásmido mitocondrial se seleccionan mediante el apareamiento con una cepa de prueba. 6) La construcción mitocondrial se integra en el genoma mitocondrial en el locus deseado mediante el acoplamiento de ^{la cepa} sintética (donante) con la cepa aceptora mediante un proceso conocido como citoducción. 7) El receptor positivo, cepa haploide portadora de la construcción mitocondrial, se selecciona y purifica en diferentes medios. Abreviaturas: WPs = partículas de tungsteno; ADNmt = ADN mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Transformación de células con la construcción de ADN destinada a integrarse en el genoma mitocondrial (Figura 1, pasos 1-4)
Aunque es posible transformar directamente una levadura que contiene un genoma mitocondrial completo (rho⁺), la transformación es 10-20 veces más eficiente si las células carecen de ADN mitocondrial (rho⁰)²⁴. Las partículas de tungsteno (WP) están recubiertas con dos plásmidos diferentes que se cotransformarán. El primero es un vector de expresión de μ levadura 2 portador de un marcador de auxotrofia, como LEU2 o URA3 (por ejemplo, YEp351 o YEp352, respectivamente). Si la introducción biológica del ADN en las células de levadura tiene éxito, los transformadores crecerán en el medio auxotrofia (es decir, un medio que carece de leucina o uracilo). Este plásmido es útil para hacer la primera selección de las células que adquirieron el plásmido nuclear; De lo contrario, el número de colonias resultantes saturaría la placa. El segundo plásmido es un plásmido bacteriano (como pBluescript o similar) que contiene la construcción mitocondrial destinada a integrarse en el genoma mitocondrial. El constructo debe contener al menos 100 nt de secuencias mitocondriales flanqueantes de 5′ y 3′ para su recombinación con la región mitocondrial de interés. En nuestra experiencia, es más probable que las secuencias flanqueantes más grandes se recombinen con éxito con el locus objetivo en el genoma mitocondrial.

Un ejemplo específico se muestra en la Figura 2²⁵. En este ejemplo, el objetivo era eliminar la región del gen mitocondrial COX1 que codifica para los últimos 15 aminoácidos de la proteína correspondiente (Cox1ΔC15) (Figura 2A). El plásmido bacteriano portador de la mutación COX1ΔC15 contenía 395 nt y 990 nt de las regiones no traducidas 5′ y 3′ del gen, respectivamente. El plásmido se derivó de pBluescript (pXPM61) y, junto con el plásmido 2 μ YEp352, se coprecipitaron en la superficie de los WP (Figura 2B). A continuación, los WP se introdujeron mediante bombardeo de microproyectiles en la cepa receptora seleccionada (Figura 2C). Esta cepa, denominada NAB69²⁶, es una cepa MATa, rho⁰ que contiene los alelos kar1-1 y ade2 (la importancia de estas características se discute a continuación). Las células se sembraron en medios de bombardeo carentes de uracilo para seleccionar aquellas que adquirieron el plásmido 2 μ (Figura 2C). Las células se cultivaron durante 5-7 noches a 30 °C.

Selección de las células que adquirieron el plásmido bacteriano que contiene la construcción mitocondrial y el plásmido nuclear 2 μ portador del marcador de auxotrofia (Figura 1, paso 5)
Las colonias positivas mantendrán muchas copias del plásmido bacteriano en sus mitocondrias²². Dado que las células transformadas son originalmente rho⁰, no hay secuencias mitocondriales que apoyen la traducción de la construcción mitocondrial presente en el plásmido; por lo tanto, el gen mitocondrial transformado no se expresará. Es necesario acoplar los transformantes con una cepa probadora para detectar las colonias de levadura que adquirieron el plásmido mitocondrial. El genoma mitocondrial de la cepa de prueba contiene una versión mutada no funcional del gen de interés. Después del apareamiento, las mitocondrias se fusionarán y la secuencia mitocondrial incluida en el plásmido transformado se recombinará con el gen mitocondrial mutado de la cepa del probador; en consecuencia, la recuperación del gen WT reconstituirá la función. El diploide resultante tendrá un fenotipo positivo detectable (generalmente la capacidad de crecer en un medio respiratorio o en un medio que carezca de arginina). Las células positivas que transportan el plásmido bacteriano en las mitocondrias se denominan ^{“células rho} sintéticas”. En el ejemplo específico de la Figura 2D, las células rho^– sintéticas que llevaban la construcción COX1ΔC15 (llamada XPM199) se replicaron en un medio que carecía de uracilo (esta es la placa maestra a partir de la cual se purificaron las colonias positivas). También se replicaron en un césped de la cepa L45²⁷ de la cepa de prueba, que contiene la mutación no funcional cox1D369N. Después de aparearse durante dos noches, el genoma mitocondrial de L45 y XPM199 se recombinó, lo que resultó en un gen COX1 funcional; Por lo tanto, los diploides recuperaron la capacidad de crecer en medios respiratorios. De la placa maestra, elegimos las colonias positivas. Se rayaron en placas que carecían de uracilo y se repitieron las pruebas selectivas para ^{obtener células ro} – das sintéticas puras (Figura 2E). Es importante tener en cuenta que la placa de prueba es solo para la identificación ^{de colonias} de rho sintéticas, y los mutantes no se pueden recuperar de estas placas.

Integración del constructo en el genoma mitocondrial de la cepa prevista
Este paso se logra mediante un proceso llamado citoducción^28,29 (Figura 1, paso 6). En este enfoque, la cepa ro^– sintética (cepa donante) se acopla a la cepa aceptora prevista del tipo de apareamiento opuesto. Un requisito esencial es que al menos una de las dos cepas de apareamiento sea portadora de la mutación kar1-1 para impedir la fusión nuclear³⁰. Por lo tanto, el apareamiento de las dos células produce un cigoto binucleado (Figura 3). La red mitocondrial de las células parentales (donante y aceptor) se fusiona y las moléculas de ADN mitocondrial se recombinan. Los cigotos binucleados se incuban/recuperan para permitir la gemación, que producirá células haploides. Estos haploides llevan el fondo nuclear de una de las células parentales. De manera similar, los haploides pueden transportar el ADN mitocondrial de la célula parental o del ADN mitocondrial recombinado de interés. Sin embargo, la mutación kar1-1 no es 100% efectiva, y algunos diploides verdaderos se formarán durante el apareamiento ^28,29. La ^cepa sintética (donante, XPM199) portaba el alelo kar1-1 en el ejemplo. Como marcador selectivo, presentaba el alelo ade2, lo que lo convierte en un auxótrofo de la adenina (Figura 4). La cepa aceptora fue XPM10, una cepa rho⁺ portadora de la construcción cox1Δ::ARG8^m, donde el reporte ARG8^m reemplazó a los codones COX1 en el genoma mitocondrial⁷. La mezcla de ambos cultivos celulares se añadió a una placa YPD como gota para permitir el apareamiento. Después de 3-5 h, las células se observaron bajo un microscopio óptico para detectar la formación de shmoos (Figura 3B), una forma celular asociada con el apareamiento. Después del tiempo de incubación/recuperación, los cigotos binucleares se sembraron en un medio que carecía de adenina para evitar el crecimiento de las células donantes.

Selección de la cepa haploide portadora del genoma mitocondrial de interés (Figura 1, paso 7)
Después de la citoducción hay una mezcla de células donantes, aceptoras y diploides. Por lo tanto, después de la incubación/recuperación de los cigotos binucleados, las células deben cultivarse en diferentes medios selectivos para identificar y purificar los haploides de interés. Los medios selectivos dependen de los genotipos del donante, las cepas aceptoras y la construcción mitocondrial prevista. Sin embargo, en general, el razonamiento para elegir el medio selectivo es: i) después de la incubación/recuperación, la mezcla de citoducción se cultiva en un medio selectivo donde la cepa parental donante no puede crecer. En el ejemplo específico de la Figura 4A,B, el donante ^(cepa sintética) es portador del alelo ade2 no funcional. Por lo tanto, la mezcla de citoducción debe incubarse en una placa mediana que carezca de adenina. Esta es la placa maestra. ii) Una vez que las colonias crecen, la placa maestra se replica nuevamente en un medio que carece de adenina (para generar una nueva placa maestra a partir de donde se purificarán las colonias positivas de interés), y a continuación, en un medio donde solo pueden crecer diploides. Esto es necesario para evitar una mayor purificación inadvertida de las colonias diploides. En el caso del ejemplo de la Figura 4C, solo los diploides pueden crecer en medios que carecen de leucina. iii) La placa maestra también se replica en medios donde solo crecerán aquellos haploides aceptores que incorporaron el ADN mitocondrial de interés. En el ejemplo de la Figura 4C, los haploides crecen en medios respiratorios que contienen etanol/glicerol como fuente de carbono, ya que la proteína Cox1ΔC15 es funcional. La cepa rho⁺ resultante que contiene el ADNmt de interés se denominó XPM209²⁵. Las cepas utilizadas en la Figura 2 y la Figura 4 se enumeran en la Tabla 1.

Figura 2: Diagrama que describe un ejemplo específico de transformación mitocondrial y selección de células rho positivas. (A) La modificación prevista del genoma mitocondrial fue una deleción de la región que codifica los últimos 15 aminoácidos de la subunidad Cox1 (Cox1ΔC15). (B) Los WP se recubrieron con dos plásmidos para transformar las células de levadura. Uno de ellos fue el plásmido de 2 μ Yep352 que se dirigió y expresó en el núcleo. El otro fue el plásmido pXPM61, que contiene el alelo COX1ΔC15 más 395 nt y 990 nt de las COX1 5′ y 3′-UTRs, respectivamente. (C) Los WP se introdujeron en células de la cepa NAB69, que carece de ADN mitocondrial (cepa rho⁰). Las colonias transformantes obtenidas de las placas de bombardeo se replicaron en un medio que carecía de uracilo, el marcador auxotrófico del plásmido nuclear YEp352. (D) Para seleccionar ^{las colonias} de rho positivas, se replicó la placa -URA en un medio que carecía de uracilo. Esta era la placa maestra de la que se recogían y aislaban las colonias positivas. También se replicó en placas con medios enriquecidos (YPD) y un césped de una cepa de prueba. Durante el apareamiento, el ^ADN romomitocondrial sintético se recombinó con el ADN mitocondrial de la cepa de prueba, L45²⁷, que porta una mutación en el gen COX1 (D369N). Los diploides que crecían en los medios respiratorios contenían el ADN transformado. Las colonias correspondientes se recogían de la placa maestra para refrescarlas y purificarlas. Para ayudar a identificar las colonias positivas en la placa maestra a lo largo de todas las réplicas de placas, se hicieron marcas con un marcador permanente en los bordes de las placas (líneas verdes). (E) Las colonias positivas seleccionadas se volvieron a rayar en un medio que carecía de uracilo. Esta era la nueva placa maestra. Al igual que en D, se llevaron a cabo dos rondas más de pruebas para purificar ^{las colonias} de rho sintéticas. Abreviaturas: WPs = partículas de tungsteno; ADNmt = ADN mitocondrial; -URA/Sorb = sin uracilo/ que contiene Sorbitol; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diagrama que describe el procedimiento de citoducción. (A) Descripción general de cómo se aparean las células durante la citoducción. Durante la citoducción, las mitocondrias de las cepas donante y aceptora se fusionan para que el ADN mitocondrial de ambas cepas se recombine. Dado que la fusión nuclear se reduce debido a la mutación kar1-1 ³⁰, se forman cigotos binucleares. Después de un tiempo de incubación/recuperación, se seleccionan los cigotos binucleares y los aceptores haploides que contienen la mutación mitocondrial prevista. (B) El apareamiento de ^{la cepa} sintética (donante) y la cepa aceptora a través de la citoducción permite la formación de shmoos (flechas rojas), una forma característica de la levadura de apareamiento. La imagen fue tomada bajo un microscopio óptico con un objetivo de 100x. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Diagrama que describe un ejemplo específico de citoducción para integrar la mutación COX1ΔC15 en el genoma mitocondrial. (A) Se mezclaron cultivos líquidos de la cepa sintética rho^– (donante, XPM199) y la cepa de interés (aceptor, XPM10) para aparearse. Después de la formación de shmoo, la mezcla se recuperó en un cultivo líquido durante 2-4 h. A continuación, la mezcla de citoducción se extendió en una placa con un medio que carecía de adenina para evitar el crecimiento de las células donantes. (B) Representación esquemática de los eventos de recombinación del ADN mitocondrial del donante (XPM199) y del aceptor (XPM10) durante la citoducción. (C) La placa maestra se replicó en diferentes medios selectivos para identificar y purificar aquellos haploides que integraban el gen mitocondrial previsto en el ADN del orgánulo (XPM209)²⁵. Abreviaturas: -ADE = falta adenina; -LEU = falta de leucina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.