베이커의 미토콘드리아 변환

효모 Saccharomyces cerevisiae는 미토콘드리아 생물 발생을 연구하는 데 사용되는 널리 알려진 모델입니다. 효모는 혐기성, 통성 유기체이기 때문에 호흡을 손상시키는 돌연변이를 도입하는 원인과 결과를 광범위하게 연구할 수 있습니다. 또한 이 유기체는 미토콘드리아 경로를 연구할 수 있는 친근한 유전적 및 생화학적 도구를 보유하고 있습니다. 그러나 호흡 복합체 조립 및 미토콘드리아 단백질 합성의 메커니즘을 탐구하기 위한 가장 강력한 자원 중 하나는 미토콘드리아를 변형시키고 세포 소기관의 게놈을 수정할 수 있는 능력입니다. 이전에는 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 점 돌연변이 또는 작은 결실/삽입(^1,2,3,4,5)을 도입하고, 유전자 ^6,7을 삭제하고, 유전자 재배열(^7,8)을 만들고, 미토콘드리아 단백질(^9,10)에 에피토프를 추가하고, 핵에서 미토콘드리아(¹¹)로 유전자를 재배치하는 것이 도움이 되었다.¹², BarStar¹³, GFP^14,15, luciferase¹⁶ 및 가장 널리 사용되는 ARG8^m17,18과 같은 리포터 유전자를 소개합니다. 미토콘드리아 게놈 변형을 통해 다른 방법으로는 이해하기 어려웠을 메커니즘을 해부하고 식별할 수 있게 되었습니다. 예를 들어, 미토콘드리아 DNA의 COX1 유전자좌에 삽입된 ARG8^m 리포터 유전자는 Mss51이 Cox1 생물 발생에서 이중 역할을 한다는 것을 이해하는 데 결정적이었습니다. 첫째, COX1 mRNA의 번역 활성제이며, 둘째, 새로 만들어진 Cox1 단백질 ^7,19의 조립 샤페론입니다. 이 연구는 S. cerevisiae 미토콘드리아를 형질전환시키는 상세한 방법을 제시합니다. 미토콘드리아 형질전환 프로토콜은 16,20,21,22,23 이전에 발표되었지만, 방법의 다양한 단계와 세부 사항을 철저히 이해하려면 비디오를 통한 시각적 접근이 필수적입니다. 이 방법은 다양한 단계로 구성되며 네 가지 일반적인 단계로 나뉩니다.

그림 1 : 고속 미세 발사체 충격에 의한 미토콘드리아 변환 절차 개요 : 1) 텅스텐 입자는 DNA 코팅 전에 멸균 및 제조됩니다. 2) 두 개의 서로 다른 플라스미드가 WP 표면에 침전됩니다. 하나는 미토콘드리아 기질로 향하는 구조를 포함하는 박테리아 플라스미드입니다. 다른 하나는 auxotrophy marker를 운반하는 핵 효모 발현 벡터입니다. 3) 미토콘드리아 DNA(rho⁰)가 결핍된 수용체 효모 균주는 미토콘드리아 유전자 발현의 포도당 억제를 가하지 않는 갈락토스 또는 라피노스와 같은 발효 탄소원에서 성장합니다^34,35. 문화는 폭격 매체를 포함하는 페트리 접시에 퍼집니다. 4) 플라스미드로 코팅된 WP는 고속 미세발사체 충격에 의해 수용체 변형에 발사됩니다. 5) 미토콘드리아 플라스미드를 함유하는 positive synthetic ^rho-colony는 tester strain과 교배하여 선택합니다. 6) 미토콘드리아 구조체는 세포유도(cytoduction)로 알려진 과정을 통해 합성 ^rho-train(donor)을 acceptor train과 결합함으로써 원하는 유전자좌에서 미토콘드리아 게놈에 통합됩니다. 7) 미토콘드리아 구조를 운반하는 양성 수용체, 반수체 균주는 다른 매체에서 선택되고 정제됩니다. 약어 : WP = 텅스텐 입자; mtDNA = 미토콘드리아 DNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

미토콘드리아 게놈에 통합하기 위한 DNA 구조를 가진 세포의 형질전환 (그림 1, 1-4단계)
완전한 미토콘드리아 게놈(rho⁺)을 포함하는 효모를 직접 형질전환하는 것이 가능하지만, 세포에 미토콘드리아 DNA(rho 0)가 없는 경우 형질전환이 10-20배 더 효율적입니다(rho⁰)²⁴. 텅스텐 입자 (WP)는 공 형질전환 될 두 개의 다른 플라스미드로 코팅됩니다. 첫 번째는 LEU2 또는 URA3 (예: 각각 YEp351 또는 YEp352)와 같은 보조 영양 마커를 운반하는 효모 2 μ 발현 벡터입니다. 효모 세포에 DNA를 생물학적으로 도입하는 데 성공하면, 형질전환체는 보조영양 배지(즉, 류신 또는 우라실이 결핍된 배지)에서 성장할 것이다. 이 플라스미드는 핵 플라스미드를 획득한 세포의 첫 번째 선택을 하는 데 도움이 됩니다. 그렇지 않으면, 결과 콜로니의 수가 플레이트를 포화시킬 것입니다. 두 번째 플라스미드는 미토콘드리아 게놈에 통합되도록 의도된 미토콘드리아 구조를 포함하는 박테리아 플라스미드(예: pBluescript 또는 이와 유사)입니다. 구조체는 관심 미토콘드리아 영역과의 재조합을 위해 최소 100nt의 5′ 및 3′ 측면 미토콘드리아 서열을 포함해야 합니다. 우리의 경험에 따르면, 더 큰 플랭킹 염기서열은 미토콘드리아 게놈의 표적 자리와 성공적으로 재결합할 가능성이 더 높습니다.

구체적인 예가 그림 2²⁵에 나와 있습니다. 이 예에서 목표는 해당 단백질(Cox1ΔC15)의 마지막 15개 아미노산을 암호화하는 미토콘드리아 COX1 유전자의 영역을 삭제하는 것이었습니다(그림 2A). COX1ΔC15 돌연변이를 운반하는 박테리아 플라스미드는 유전자의 5′ 및 3′ 번역되지 않은 영역의 각각 395 nt 및 990 nt를 포함하고 있었습니다. 플라스미드는 pBluescript(pXPM61)에서 파생되었으며 2개의 μ 플라스미드 YEp352와 함께 WP 표면에 응고되었습니다(그림 2B). 그런 다음 WP는 마이크로 발사체 충격에 의해 선택된 수용 균주에 도입되었습니다(그림 2C). NAB69²⁶으로 명명된 이 균주는 kar1-1 및 ade2 대립유전자를 지닌 MATa, rho⁰ 균주입니다(이러한 특성의 중요성은 아래에서 논의됨). 세포는 2 μ 플라스미드를 획득한 세포를 선택하기 위해 우라실이 결핍된 충격 매체에 도말되었습니다(그림 2C). 세포를 30°C에서 5-7박 동안 성장시켰다.

미토콘드리아 구조를 포함하는 박테리아 플라스미드와 auxotrophy 마커를 운반하는 핵 2 μ 플라스미드를 획득한 세포의 선택 (그림 1, 5단계)
양성 콜로니는 미토콘드리아²²에서 박테리아 플라스미드의 많은 복사본을 유지합니다. 형질전환된 세포는 원래 rho⁰이기 때문에, 어떤 미토콘드리아 서열도 플라스미드에 존재하는 미토콘드리아 구조체의 번역을 지원하지 않습니다. 따라서 형질전환된 미토콘드리아 유전자는 발현되지 않습니다. 미토콘드리아 플라스미드를 획득한 효모 콜로니를 검출하기 위해 형질전환체를 테스터 균주와 결합해야 합니다. 테스터 균주의 미토콘드리아 게놈에는 관심 유전자의 비기능적 돌연변이 버전이 포함되어 있습니다. 교배 후, 미토콘드리아는 융합하고, 형질전환된 플라스미드에 포함된 미토콘드리아 서열은 테스터 균주에서 돌연변이된 미토콘드리아 유전자와 재결합합니다. 결과적으로, WT 유전자의 회복은 기능을 재구성할 것입니다. 생성된 이배체는 검출 가능한 양성 표현형(일반적으로 호흡기 배지 또는 아르기닌이 부족한 배지에서 성장할 수 있는 능력)을 갖습니다. 미토콘드리아에서 박테리아 플라스미드를 운반하는 양성 세포는 “합성 ^rho-cell“이라고 불립니다. 도 2D의 구체적인 예에서, COX1ΔC15 구조체(XPM199로 명명됨)를 운반하는 합성 ^rho-cell은 우라실이 결핍된 매체(이것은 양성 콜로니가 정제된 마스터 플레이트)에 복제 도금되었습니다. 그들은 또한 비기능성 돌연변이 cox1D369N을 포함하는 테스터 균주 L45²⁷ 잔디밭에 복제 도금되었습니다. 2박 동안 짝짓기를 한 후, L45와 XPM199의 미토콘드리아 게놈이 재결합되어 기능적인 COX1 유전자가 생성되었습니다. 따라서 이배체는 호흡 매체에서 자랄 수 있는 능력을 회복했습니다. 마스터 플레이트에서 우리는 긍정적 인 식민지를 선택했습니다. 우라실이 결핍된 플레이트에 줄무늬를 표시하고, 순수한 합성 로^셀을 얻기 위해 선택적 테스트를 반복했습니다(그림 2E). 테스트 플레이트는 합성 로^콜로니를 식별하기 위한 용도로만 사용되며 이러한 플레이트에서 돌연변이를 회수할 수 없다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

의도된 균주의 미토콘드리아 게놈에 구조체의 통합
이 단계는 cytoduction^28,29라는 과정에 의해 달성됩니다(그림 1, 단계 6). 이 접근법에서, 합성 ^rho-strain (donor strain)는 반대 결합 유형의 의도된 acceptor train에 결합됩니다. 필수 요구사항은 두 개의 짝짓기 균주 중 적어도 하나가 핵융합을 방해하기 위해 kar1-1 돌연변이를 운반하는 것이다(³⁰). 따라서 두 세포의 결합은 이핵 접합체(binucleated zygote)를 생성합니다(그림 3). 부모 세포(공여자와 수용자)의 미토콘드리아 네트워크가 융합되고 미토콘드리아 DNA 분자가 재결합합니다. 이핵화된 접합체는 싹을 틔울 수 있도록 배양/회수되어 반수체 세포를 생성합니다. 이 반수체는 부모 세포 중 하나의 핵 배경을 가지고 있습니다. 유사하게, 반수체는 부모 세포 또는 관심 있는 재조합된 미토콘드리아 DNA에서 미토콘드리아 DNA를 운반할 수 있습니다. 그러나 kar1-1 돌연변이는 100% 효과적이지 않으며 짝짓기^28,29 중에 일부 진정한 이배체가 형성됩니다. 합성 rho^– 균주(donor, XPM199)는 예에서 kar1-1 대립유전자를 운반했습니다. 선택적 마커로서, 그것은 ade2 대립 유전자를 가지고 있었고, 아데닌에 대한 보조 영양 식물이되었습니다 (그림 4). 수용체 균주는 cox1Δ::ARG8^m 구조를 지닌 rho⁺ 균주인 XPM10이었으며, 여기서 리포터 ARG8^m은 미토콘드리아 게놈⁷의 COX1 코돈을 대체했습니다. 두 세포 배양물의 혼합물을 교합을 허용하기 위해 YPD 플레이트에 방울로 첨가하였다. 3-5 시간 후, 세포는 교미와 관련된 세포 모양 인 shmoos (그림 3B)의 형성을 감지하기 위해 광학 현미경으로 관찰되었습니다. 배양/회수 시간 후, 공여체 세포의 성장을 방지하기 위해 아데닌이 결핍된 배지에 이핵 접합체를 도말했습니다.

관심 미토콘드리아 게놈을 운반하는 반수체 균주의 선택 (그림 1, 7단계)
donor, acceptor 및 diploid cell의 혼합물이 세포 duction 후에 존재합니다. 따라서 이핵형 접합체의 배양/회수 후에는 관심 있는 반수체를 식별하고 정제하기 위해 세포를 다른 선택적 배지에서 성장시켜야 합니다. 선택적 배지는 donor의 유전자형, acceptor 균주 및 의도된 미토콘드리아 구조에 따라 달라집니다. 그러나, 일반적으로, 선택적 배지를 선택하는 이유는 다음과 같다: i) 배양/회복 후, 세포유도 혼합물은 기증자 부모 균주가 성장할 수 없는 선택적 배지에서 성장한다. 그림 4A,B의 특정 예에서, 공여체(합성 rho^– strain)는 비기능적 ade2 대립유전자를 운반합니다. 따라서, 세포유도 혼합물은 아데닌이 결핍된 배지 플레이트에서 배양해야 합니다. 이것은 마스터 플레이트입니다. ii) 콜로니가 성장하면 마스터 플레이트는 아데닌이 없는 배지에 다시 복제되고(관심 있는 양성 콜로니가 정제될 새로운 마스터 플레이트를 생성하기 위해) 다음으로 이배체만 자랄 수 있는 배지에 복제됩니다. 이는 이배체 콜로니의 부주의한 추가 정제를 방지하기 위해 필요합니다. 그림 4C의 예시에서, 류신이 결핍된 배지에서는 이배체만 자랄 수 있습니다. iii) 마스터 플레이트는 또한 관심 있는 미토콘드리아 DNA를 통합한 수용체 반수체만 성장하는 매체에 복제됩니다. 그림 4C의 예에서, 반수체는 Cox1ΔC15 단백질이 기능적이기 때문에 에탄올/글리세롤을 탄소원으로 포함하는 호흡 매체에서 성장합니다. 생성된 관심 mtDNA를 함유한 rho⁺ 균주는 XPM209²⁵로 명명되었습니다. 그림 2 및 그림 4에 사용된 균주는 표 1에 나열되어 있습니다.

그림 2: 미토콘드리아 변형과 양성 ^rho-cell 선택의 구체적인 예를 설명하는 다이어그램. (A) 미토콘드리아 게놈의 의도된 수정은 Cox1 소단위체(Cox1ΔC15)의 마지막 15개 아미노산에 대한 영역 코딩의 삭제였습니다. (B) WP는 효모 세포를 형질전환시키기 위해 두 개의 플라스미드로 코팅되었습니다. 하나는 2 μ 플라스미드 Yep352로, 핵에서 지시되고 발현되었습니다. 다른 하나는 플라스미드 pXPM61로, COX1ΔC15 대립유전자와 COX1 5′ 및 3′-UTR의 395 nt 및 990 nt를 각각 포함합니다. (C) WP는 미토콘드리아 DNA(rho⁰ 균주)가 없는 NAB69 균주로부터 세포에 도입되었습니다. 폭격판으로부터 수득된 형질전환체 콜로니는 핵 플라스미드 YEp352의 보조영양 마커인 우라실이 결핍된 배지에 복제되었습니다. (D) 양성 로^–콜로니를 선택하기 위해, -URA 플레이트를 우라실이 결핍된 매체에 복제하였다. 이것은 양성 콜로니를 선택하고 격리하는 마스터 플레이트였습니다. 또한 리치 미디어(YPD)가 있는 플레이트와 테스터 변형의 잔디밭에 복제되었습니다. 교배 동안, 합성 로^–미토콘드리아 DNA는 COX1 유전자(D369N)에 돌연변이를 가지고 있는 테스터 균주 L45²⁷로부터의 미토콘드리아 DNA와 재조합되었다. 호흡기에서 자란 이배체에는 변형된 DNA가 포함되어 있었습니다. 해당 콜로니는 마스터 플레이트에서 선택하여 줄무늬를 제거하고 정제했습니다. 모든 복제 도금에서 마스터 플레이트의 양극 콜로니를 식별하는 데 도움이 되도록 플레이트 가장자리에 영구적인 마커(녹색 선)로 표시했습니다. (E) 선택된 양성 콜로니는 우라실이 결핍된 매체에서 줄무늬가 생겼습니다. 이것이 새로운 마스터 플레이트였습니다. D에서와 같이, 합성 로^콜로니를 정제하기 위해 두 차례의 테스트를 더 수행했습니다. 약어 : WP = 텅스텐 입자; mtDNA = 미토콘드리아 DNA; -URA/Sorb = 소르비톨을 함유한 우라실 결핍; WT = 와일드 타입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 세포유도 절차를 설명하는 다이어그램. (A) 세포유도 중 세포가 짝을 이루는 방법에 대한 일반적인 개요. 세포유도 중에는 공여체 균주와 수용체 균주의 미토콘드리아가 융합되어 두 균주의 미토콘드리아 DNA가 재결합합니다. kar1-1 돌연변이³⁰으로 인해 핵융합이 감소하기 때문에 이중핵 접합체가 형성됩니다. 약간의 배양/회복 시간 후, 의도한 미토콘드리아 돌연변이를 포함하는 이핵 접합체 싹 및 반수체 수용체가 선택됩니다. (B) 세포duction을 통한 합성 ^rho-strain (donor)와 acceptor train의 교배는 짝짓기 효모의 특징적인 모양인 shmoos(빨간색 화살표)의 형성을 허용합니다. 이미지는 100x 대물렌즈가 있는 광학 현미경으로 촬영했습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 미토콘드리아 게놈에 돌연변이 COX1ΔC15 를 통합하기 위한 세포유도의 구체적인 예를 설명하는 다이어그램. (A) 합성 rho^– 균주(donor, XPM199)와 관심 균주(acceptor, XPM10)의 액체 배양물을 혼합하여 짝짓기를 하였다. shmoo 형성 후, 혼합물을 2-4 시간 동안 액체 배양액에서 회수 하였다. 다음으로, 세포 유도 혼합물을 공여 세포의 성장을 방지하기 위해 아데닌이 결핍된 배지가 있는 플레이트에 펴 바릅니다. (B) 세포 유도 중 공여자(XPM199)와 수용체(XPM10)의 미토콘드리아 DNA의 재조합 이벤트의 개략도. (C) 마스터 플레이트는 소기관의 DNA(XPM209)에 의도된 미토콘드리아 유전자를 통합한 반수체를 식별하고 정제하기 위해 다른 선택적 매체에 복제되었습니다(XPM209)²⁵. 약어: -ADE = 아데닌 결핍; -LEU = 류신 결핍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.