Summary

Mitochondriale transformatie bij Baker

Published: June 07, 2024
doi:

Summary

Dit werk legt uit hoe gistmitochondriën kunnen worden getransformeerd met behulp van een biolistische methode. We laten ook zien hoe de transformanten kunnen worden geselecteerd en gezuiverd en hoe de gewenste mutatie in de doelpositie binnen het mitochondriale genoom kan worden geïntroduceerd.

Abstract

Bakkersgist Saccharomyces cerevisiae wordt al tientallen jaren veel gebruikt om de mitochondriale biologie te begrijpen. Dit model heeft kennis opgeleverd over essentiële, geconserveerde mitochondriale routes tussen eukaryoten en schimmels of gistspecifieke routes. Een van de vele vermogens van S. cerevisiae is het vermogen om het mitochondriale genoom te manipuleren, wat tot nu toe alleen mogelijk is bij S. cerevisiae en de eencellige alg Chlamydomonas reinhardtii. De biolistische transformatie van gistmitochondriën stelt ons in staat om plaatsgerichte mutaties te introduceren, genherschikkingen te maken en verslaggevers te introduceren. Deze benaderingen worden voornamelijk gebruikt om de mechanismen van twee sterk gecoördineerde processen in mitochondriën te begrijpen: translatie door mitoribosomen en assemblage van ademhalingscomplexen en ATP-synthase. Mitochondriale transformatie kan echter mogelijk worden gebruikt om andere routes te bestuderen. In dit werk laten we zien hoe gistmitochondriën kunnen worden getransformeerd door middel van microprojectielbombardementen met hoge snelheid, de beoogde transformator kunnen worden geselecteerd en gezuiverd en de gewenste mutatie in het mitochondriale genoom kunnen worden geïntroduceerd.

Introduction

De gist Saccharomyces cerevisiae is een algemeen erkend model dat wordt gebruikt om mitochondriale biogenese te bestuderen. Aangezien gist een anaëroob, facultatief organisme is, is het mogelijk om de oorzaken en gevolgen van het introduceren van mutaties die de ademhaling belemmeren uitgebreid te bestuderen. Bovendien beschikt dit organisme over vriendelijke genetische en biochemische hulpmiddelen om mitochondriale routes te bestuderen. Een van de krachtigste bronnen om de mechanismen van de assemblage van respiratoire complexen en mitochondriale eiwitsynthese te onderzoeken, is echter het vermogen om mitochondriën te transformeren en het genoom van de organel te wijzigen. Eerder was het nuttig om in het mitochondriaal DNA (mtDNA) puntmutaties of kleine deleties/inserties 1,2,3,4,5 te introduceren, genen 6,7 te verwijderen, genherschikkingen te maken 7,8, epitopen toe te voegen aan mitochondriale eiwitten 9,10, genen te verplaatsen van de kern naar de mitochondriën11,12, en introduceer reportergenen zoals BarStar13, GFP14,15, luciferase16 en de meest gebruikte ARG8m17,18. Mitochondriale genoommodificaties hebben ons in staat gesteld om mechanismen te ontleden en te identificeren die anders moeilijk te begrijpen zouden zijn geweest. Het ARG8 m-reportergen dat op de COX1-locus in het mitochondriaal DNA werd ingebracht, was bijvoorbeeld cruciaal om te begrijpen dat Mss51 een dubbele rol speelt in de biogenese van Cox1. Ten eerste is het een translationele activator van het COX1-mRNA en ten tweede is het een assemblagechaperonne voor het nieuw gemaakte Cox1-eiwit 7,19. Dit werk presenteert een gedetailleerde methode om S. cerevisiae mitochondriën te transformeren. Hoewel het mitochondriale transformatieprotocol al eerder werd gepubliceerd 16,20,21,22,23, is een visuele benadering door middel van een video essentieel om de verschillende stadia en details van de methode grondig te begrijpen. De methode bestaat uit verschillende stappen en is onderverdeeld in vier algemene fasen:

Figure 1
Figuur 1: Overzicht van de mitochondriale transformatieprocedure door microprojectielbombardement met hoge snelheid: 1) De wolfraamdeeltjes worden gesteriliseerd en geprepareerd voordat ze worden gecoacht. 2) Twee verschillende plasmiden worden neergeslagen op het oppervlak van de WP’s. Een daarvan is een bacterieel plasmide dat het construct bevat dat naar de mitochondriale matrix zal worden geleid. De andere is een nucleaire gistexpressievector met een auxotrofiemarker. 3) Een receptorgiststam zonder mitochondriaal DNA (rho0) wordt gekweekt op een fermentatieve koolstofbron zoals galactose of raffinose, die geen glucoseonderdrukking van mitochondriale genexpressie uitoefent34,35. De cultuur wordt uitgespreid op petrischaaltjes met het medium bombardement. 4) WP’s bedekt met plasmiden worden naar de receptorstam geschoten door microprojectielbombardementen met hoge snelheid. 5) Positieve synthetische rho-kolonies die het mitochondriale plasmide bevatten, worden geselecteerd door te paren met een teststam. 6) Het mitochondriale construct wordt op de gewenste locus geïntegreerd in het mitochondriale genoom door de synthetische rho-stam (donor) te paren met de acceptorstam via een proces dat bekend staat als cytoductie. 7) De positieve receptor, haploïde stam die het mitochondriale construct draagt, wordt geselecteerd en gezuiverd in verschillende media. Afkortingen: WPs = wolfraamdeeltjes; mtDNA = mitochondriaal DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Transformatie van cellen met het DNA-construct dat bedoeld is om te integreren in het mitochondriale genoom (Figuur 1, stappen 1-4)
Hoewel het mogelijk is om een gist met een compleet mitochondriaal genoom (rho+) direct te transformeren, is de transformatie 10-20x efficiënter als de cellen mitochondriaal DNA (rho0)24 missen. Wolfraamdeeltjes (WP’s) worden gecoat met twee verschillende plasmiden die samen zullen worden getransformeerd. De eerste is een gist 2 μ expressievector met een auxotrofiemarker, zoals LEU2 of URA3 (bijv. YEp351 of YEp352, respectievelijk). Als de biolistische introductie van DNA in de gistcellen succesvol is, zullen de transformanten groeien op het auxotrofiemedium (d.w.z. een medium zonder leucine of uracil). Dit plasmide is nuttig bij het maken van de eerste selectie van de cellen die het nucleaire plasmide hebben verworven; Anders zou het aantal resulterende kolonies de plaat verzadigen. Het tweede plasmide is een bacterieel plasmide (zoals pBluescript of iets dergelijks) dat de mitochondriale constructie bevat die bedoeld is om te worden geïntegreerd in het mitochondriale genoom. Het construct moet ten minste 100 nt flankerende mitochondriale sequenties van 5′ en 3′ bevatten voor recombinatie met het mitochondriale gebied van belang. In onze ervaring is de kans groter dat grotere flankerende sequenties met succes recombineren met de doellocus in het mitochondriale genoom.

Een specifiek voorbeeld is weergegeven in figuur 225. In dit voorbeeld was het doel om het gebied van het mitochondriale COX1-gen te verwijderen dat codeert voor de laatste 15 aminozuren van het overeenkomstige eiwit (Cox1ΔC15) (Figuur 2A). Het bacteriële plasmide met de COX1ΔC15-mutatie bevatte respectievelijk 395 nt en 990 nt van de 5′ en 3′ niet-vertaalde regio’s van het gen. Het plasmide was afgeleid van pBluescript (pXPM61) en samen met het 2 μ plasmide YEp352 werden ze gecoprecipiteerd op het oppervlak van WP’s (Figuur 2B). De WP’s werden vervolgens door middel van een microprojectielbombardement in de geselecteerde ontvangende stam geïntroduceerd (Figuur 2C). Deze stam, NAB6926 genaamd, is een MATa, rho 0-stam met de allelen kar1-1 en ade2 (het belang van deze kenmerken wordt hieronder besproken). De cellen werden geplateerd op bombardementsmedia zonder uracil om die cellen te selecteren die het 2 μ plasmide hadden verworven (Figuur 2C). De cellen werden gedurende 5-7 nachten bij 30 °C gekweekt.

Selectie van de cellen die het bacteriële plasmide met het mitochondriale construct en het nucleaire 2 μ plasmide met de auxotrofiemarker hebben verworven (Figuur 1, stap 5)
De positieve kolonies zullen veel kopieën van het bacteriële plasmide in hun mitochondriën behouden22. Aangezien de getransformeerde cellen oorspronkelijk rho0 zijn, ondersteunen geen mitochondriale sequenties de translatie van het mitochondriale construct dat aanwezig is in het plasmide; Daarom zal het getransformeerde mitochondriale gen niet tot expressie worden gebracht. Het is noodzakelijk om de transformatoren te paren met een teststam om de gistkolonies te detecteren die het mitochondriale plasmide hebben verworven. Het mitochondriale genoom van de teststam bevat een niet-functionele gemuteerde versie van het gen in kwestie. Na de paring zullen de mitochondriën samensmelten en zal de mitochondriale sequentie die in het getransformeerde plasmimide is opgenomen, recombineren met het gemuteerde mitochondriale gen van de testerstam; bijgevolg zal het herstel van het WT-gen de functie herstellen. De resulterende diploïde zal een detecteerbaar positief fenotype hebben (meestal het vermogen om te groeien in een respiratoir medium of een medium zonder arginine). De positieve cellen die het bacteriële plasmide in mitochondriën dragen, worden “synthetische rho-cellen ” genoemd. In het specifieke voorbeeld van figuur 2D werden synthetische rho-cellen met het COX1ΔC15-construct (XPM199 genaamd) gerepliceerd op een medium zonder uracil (dit is de hoofdplaat waaruit positieve kolonies werden gezuiverd). Ze werden ook gerepliceerd op een tester stam L4527 gazon, dat de niet-functionele mutatie cox1D369N bevat. Na twee nachten paren recombineerde het mitochondriale genoom van L45 en XPM199, wat resulteerde in een functioneel COX1-gen ; Daarom herstelden de diploïden het vermogen om te groeien op respiratoire media. Van de moederplaat hebben we de positieve kolonies geplukt. Ze werden gestreept op platen zonder uracil en de selectieve tests werden herhaald om zuivere synthetische rho-cellen te verkrijgen (Figuur 2E). Het is belangrijk op te merken dat de testplaat alleen bedoeld is voor de identificatie van synthetische rho-kolonies en dat mutanten niet uit deze platen kunnen worden gehaald.

Integratie van het construct in het mitochondriale genoom van de beoogde stam
Deze stap wordt bereikt door een proces dat cytoductie28,29 wordt genoemd (Figuur 1, stap 6). Bij deze benadering wordt de synthetische rho-stam (donorstam) gekoppeld aan de beoogde acceptorstam van het tegenovergestelde paringstype. Een essentiële vereiste is dat ten minste één van de twee parende stammen de kar1-1-mutatie draagt om kernfusie te belemmeren30. Vandaar dat de paring van de twee cellen een tweekernige zygote produceert (Figuur 3). Het mitochondriale netwerk van de oudercellen (donor en acceptor) versmelt en de mitochondriale DNA-moleculen recombineren. De tweekernige zygoten worden geïncubeerd/hersteld om knopvorming mogelijk te maken, die haploïde cellen zullen produceren. Deze haploïden dragen de nucleaire achtergrond van een van de oudercellen. Evenzo kunnen haploïden het mitochondriale DNA van de ouderlijke cel of het gerecombineerde mitochondriale DNA van belang dragen. De kar1-1-mutatie is echter niet 100% effectief en tijdens de paring zullen enkele echte diploïden worden gevormd28,29. De synthetische rho-stam (donor, XPM199) droeg in het voorbeeld het kar1-1 allel. Als selectieve marker had het het ade2-allel, waardoor het een auxotroof voor adenine is (Figuur 4). De acceptorstam was XPM10, een rho+-stam met de cox1Δ::ARG8m-constructie, waarbij de verslaggever ARG8m de COX1-codons in het mitochondriale genoom7 verving. Het mengsel van beide celculturen werd als druppel aan een YPD-plaat toegevoegd om paring mogelijk te maken. Na 3-5 uur werden de cellen onder een lichtmicroscoop geobserveerd om de vorming van shmoos te detecteren (Figuur 3B), een celvorm die verband houdt met paring. Na de incubatie-/hersteltijd werden de binucleaire zygoten uitgeplateerd op een medium zonder adenine om de groei van de donorcellen te voorkomen.

Selectie van de haploïde stam die het mitochondriale genoom van belang draagt (Figuur 1, stap 7)
Een mengsel van donor-, acceptor- en diploïde cellen is aanwezig na cytoductie. Daarom moeten na de incubatie/herstel van de tweekernige zygoten cellen worden gekweekt in verschillende selectieve media om de haploïden van belang te identificeren en te zuiveren. De selectieve media zijn afhankelijk van de genotypen van de donor, acceptorstammen en de beoogde mitochondriale constructie. Over het algemeen is de redenering voor het kiezen van de selectieve media echter: i) na incubatie/herstel wordt de cytoductiemix gekweekt op een selectief medium waar de donorouderstam niet kan groeien. In het specifieke voorbeeld in figuur 4A,B draagt de donor (synthetische rho-stam) het niet-functionele ade2-allel. Het cytoductiemengsel moet dus worden geïncubeerd op een middelgrote plaat zonder adenine. Dit is de moederplaat. ii) Zodra de kolonies groeien, wordt de hoofdplaat opnieuw gerepliceerd op een medium zonder adenine (om een nieuwe hoofdplaat te genereren van waaruit de positieve kolonies van belang zullen worden gezuiverd), en vervolgens op een medium waar alleen diploïden kunnen groeien. Dit is nodig om verdere onbedoelde zuivering van diploïde kolonies te voorkomen. In het geval van het voorbeeld uit figuur 4C kunnen alleen diploïden groeien op media zonder leucine. iii) De hoofdplaat wordt ook gerepliceerd op media waar alleen die acceptor-haploïden zullen groeien die het mitochondriale DNA van belang hebben opgenomen. In het voorbeeld van figuur 4C groeien haploïden op respiratoire media die ethanol/glycerol als koolstofbron bevatten, aangezien het Cox1ΔC15-eiwit functioneel is. De resulterende rho+-stam met het mtDNA van belang kreeg de naam XPM20925. De in figuur 2 en figuur 4 gebruikte stammen zijn vermeld in tabel 1.

Figure 2
Figuur 2: Diagram met een specifiek voorbeeld van mitochondriale transformatie en selectie van positieve rho-cellen. (A) De beoogde wijziging van het mitochondriale genoom was een deletie van het gebied dat codeert voor de laatste 15 aminozuren van de Cox1-subeenheid (Cox1ΔC15). (B) WP’s werden gecoat met twee plasmiden om gistcellen te transformeren. Een daarvan was het 2 μ plasmide Yep352 dat werd gericht en tot expressie werd gebracht in de kern. De andere was plasmide pXPM61, dat het COX1ΔC15-allel bevat plus respectievelijk 395 nt en 990 nt van de COX1 5′- en 3′-UTR’s. (C) De WP’s werden geïntroduceerd in cellen van de stam NAB69, die mitochondriaal DNA mist (rho0-stam). Transformatiekolonies verkregen uit de bombardementsplaten werden gerepliceerd op een medium zonder uracil, de auxotrofe marker van het nucleaire plasmide YEp352. (D) Om de positieve rho-kolonies te selecteren, werd de –URA-plaat gerepliceerd op een medium zonder uracil. Dit was de hoofdplaat waaruit de positieve kolonies werden geplukt en geïsoleerd. Het werd ook gerepliceerd op platen met rich media (YPD) en een gazon van een testerstam. Tijdens de paring werd het synthetische rho-mitochondriaal DNA gerecombineerd met het mitochondriaal DNA van de testerstam, L4527, die een mutatie in het COX1-gen (D369N) draagt. De diploïden die op respiratoire media groeiden, bevatten het getransformeerde DNA. De bijbehorende kolonies werden van de moederplaat geplukt om te herscheppen en te zuiveren. Om te helpen bij het identificeren van de positieve kolonies in de hoofdplaat tijdens alle replicabeplating, werden markeringen gemaakt met een permanente marker op de randen van de platen (groene lijnen). (E) De geselecteerde positieve kolonies werden gestalte op een medium zonder uracil. Dit was de nieuwe moederplaat. Evenals in D werden nog twee testrondes uitgevoerd om de synthetische rho-kolonies te zuiveren. Afkortingen: WPs = wolfraamdeeltjes; mtDNA = mitochondriaal DNA; -URA/Sorb = zonder uracil/ bevattend Sorbitol; WT = wild type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Diagram van de cytoductieprocedure. (A) Algemeen overzicht van hoe cellen paren tijdens cytoductie. Tijdens cytoductie smelten mitochondriën van de donor- en acceptorstammen samen, zodat mitochondriaal DNA van beide stammen recombineert. Omdat kernfusie wordt verminderd als gevolg van de kar1-1-mutatie 30, worden binucleaire zygoten gevormd. Na enige incubatie-/hersteltijd worden de binucleaire zygoten knop- en haploïde acceptoren die de beoogde mitochondriale mutatie bevatten, geselecteerd. (B) Paring van de synthetische rho-stam (donor) en de acceptorstam door middel van cytoductie maakt de vorming van shmoos (rode pijlen) mogelijk, een karakteristieke vorm van paringsgist. De foto is gemaakt onder een lichtmicroscoop met een 100x objectief. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Diagram met een specifiek voorbeeld van cytoductie om de mutatie COX1ΔC15 in het mitochondriale genoom te integreren. (A) Vloeibare culturen van de synthetische rho-stam (donor, XPM199) en de betreffende stam (acceptor, XPM10) werden gemengd om te paren. Na shmoo-vorming werd het mengsel gedurende 2-4 uur teruggewonnen in een vloeibare cultuur. Vervolgens werd de cytoductiemix uitgespreid op een plaat met een medium zonder adenine om de groei van de donorcellen te voorkomen. (B) Schematische weergave van de recombinatiegebeurtenissen van het mitochondriaal DNA van de donor (XPM199) en de acceptor (XPM10) tijdens cytoductie. (C) De hoofdplaat werd gerepliceerd op verschillende selectieve media om die haploïden te identificeren en te zuiveren die het beoogde mitochondriale gen in het DNA van de organel integreerden (XPM209)25. Afkortingen: -ADE = zonder adenine; -LEU = gebrek aan leucine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

OPMERKING: We raden aan om voor elk construct zes transformaties uit te voeren, aangezien de mitochondriale transformatie-efficiëntie meestal laag is. De samenstelling van de verschillende groeimedia is weergegeven in Tabel 2. 1. Bereiding van wolfraamdeeltjes Weeg 30 mg wolfraamdeeltjes van 0,7 μm (WP’s, microcarriers) af in een microbuisje. Voeg 1,5 ml 70% ethanol (EtOH) toe om te steriliseren. Draai de WP’s en laat ze 10 minuten rusten op kamert…

Representative Results

In dit hoofdstuk worden enkele representatieve resultaten gepresenteerd van de verschillende stadia van mitochondriale transformatie. Figuur 6 toont een bombardementsprocedure. De synthetische rhocellen droegen een bacterieel plasmide met het reporter-gen ARG8m, dat de coderende sequentie van een mitochondriaal gen zal vervangen (Figuur 6A). Na het bombardement werd de plaat gerepliceerd op een medium zonder uracil (-URA); dit is d…

Discussion

Het huidige werk beschreef hoe mitochondriën van de gist S. cerevisiae met succes kunnen worden getransformeerd. Het proces, van het bombardement met microprojectielen met hoge snelheid tot de zuivering van de beoogde giststam, duurt ~8-12 weken, afhankelijk van het aantal zuiveringsrondes van de synthetische rho-stam dat nodig is. Enkele van de kritieke stappen van de methode zijn als volgt. Ten eerste, hoe groter de flankerende gebieden die rond de mutatieplaats in het mitochondriale genconstruct w…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze publicatie werd ondersteund door Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 to XP-M]. UPD is een CONAHCYT fellow (CVU:883299). We willen Dr. Ariann Mendoza-Martínez bedanken voor de technische hulp bij de lichtmicroscoopbeelden. Biorender-licenties: DU26OMVLUU (Figuur 2); BK26TH9GXH (figuur 3); GD26TH80R5 (figuur 4); PU26THARYD (figuur 7); ML26THAIFG (figuur 9).

Materials

1 mL pipette tips Axygen T-1000-B
1.5 mL Microtube Axygen MCT-150-C
10 μL pipette tips Axygen T-10-C
15 mL conical bottom tube  Axygen SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips Axygen T-200-Y
50 mL conical bottom  tube Axygen SCT-50ML-25-S
AfiII New England BioLabs R0520S
Agarose SeaKem 50004
Analytic balance OHAUS ARA520
Autoclave TOMY ES-315
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Biolisitic Macrocarrier holder  BIO-RAD 1652322
Bunsen burner VWR 89038-528
Calcium chloride Fisher Scientific C79-500
CSM -ADE Formedium DCS0049
CSM -ARG Formedium DCS0059
CSM -LEU Formedium DCS0099
CSM -URA Formedium DCS0169
Culture glass flask KIMAX KIMBLE 25615
Culture glass tube Pyrex 9820
Dextrose BD 215520
Ethanol JT Baker  9000
Forceps Millipore 620006
Glass beads Sigma Z265926
Glass handle Sigma S4647
Glycerol JT BAKER 2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)
HSTaq  Kit PCR BIO
Microcentrifugue Eppendorf 022620100
NdeI New England BioLabs R0111L
Orbital shaker New Brunswick scientific NB-G25
PCR tubes Axygen PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System BIO-RAD 165-2257
Petri dishes (100X10) BD 252777
QIAprep Spin Miniprep Qiagen 27106
Raffinose Formedium RAF03
Replica plater Scienceware Z363391
Rupture discs 1350 Psi BIO-RAD 1652330
Sorbitol Sigma S7547
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase Thermo Scientific EL0011
Tissue Culture Rotator Thermo Scientific 88882015
Tungsten microcarriers M10 BIO-RAD 1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity
Velvet pads Bel-Art H37848-0002
Vortex  Scientifc Industries SI-0236
Wood aplicator stick PROMA 1820060
Yeast extract BD 212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids BD 291920

References

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965 (2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359 (2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), e4146 (2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. . Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. . Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144 (Pt 1), 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

Cite This Article
Camacho-Villasana, Y., Pedroza-Dávila, U., Perez-Martinez, X. Mitochondrial Transformation in Baker's Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly. J. Vis. Exp. (208), e66856, doi:10.3791/66856 (2024).

View Video