Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

A mosca da fruta Drosophila melanogaster é extremamente passível de manipulação genética e análise genética. As moscas-das-frutas transgênicas são amplamente utilizadas em pesquisas biológicas. Desde que foi desenvolvida no início da década de 1980, a transgênese mediada por transposons do elemento P tem sido indispensável para a pesquisa de Drosophila ¹. Em alguns cenários, outros transposons, como piggyBac e Minos, também foram usados para transgênese em Drosophila ². Os transgenes via transposon são inseridos aleatoriamente no genoma da Drosophila, e os níveis de expressão de transgenes em diferentes loci genômicos podem variar devido aos efeitos de posição e, portanto, não podem ser comparados². Essas desvantagens foram superadas pela transgênese site-specific mediada por phiC31³. O gene bacteriófago phiC31 codifica uma integrase que medeia a recombinação específica da sequência entre os sítios attB e attP em Drosophila³. Muitos locais de ancoragem attP foram caracterizados e estão disponíveis no Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.

O sistema de transgênese phiC31 para Drosophila tem sido amplamente utilizado pela comunidade de moscas. Entre os locais de encaixe attP, attP18 no cromossomo X, attP40 no segundo cromossomo e attP2 no terceiro cromossomo são geralmente os locais preferidos para integração de transgenes em cada cromossomo porque os transgenes nos três locais mostram altos níveis de expressão induzível enquanto têm baixos níveis de expressão basal⁵. Recentemente, no entanto, van der Graaf e colegas descobriram que o local attP40, próximo ao locus do gene Msp300, e os transgenes integrados no attP40 causam agrupamento nuclear do músculo larval em Drosophila¹⁰. Em outro estudo recente, Duan e colegas descobriram que o cromossomo attP40 homozigoto interrompe a organização glomerular normal da classe de neurônios do receptor olfativo Or47b em Drosophila¹¹. Esses achados sugerem que controles rigorosos devem ser incluídos ao projetar experimentos e interpretar dados.

Drosophila é um organismo modelo ideal para interrogação in vivo da função gênica devido ao seu curto ciclo de vida, baixo custo e fácil manutenção. A triagem genética de todo o genoma depende da construção de bibliotecas transgênicas de todo o genoma em Drosophila 12,13,14,15. Anteriormente, geramos 5551 construções UAS-cDNA / ORF com base no sistema binário GAL4 / sequência ativadora upstream (GAL4 / UAS), cobrindo 83% dos genes de Drosophila conservados em humanos na Coleção de Ouro¹⁶ do Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). Os plasmídeos UAS-cDNA/ORF podem ser usados para a criação de uma biblioteca transgênica de UAS-cDNA/ORF em Drosophila. A tecnologia eficiente de microinjeção de embriões pode acelerar a criação de bibliotecas de moscas transgênicas.

Para microinjeção de embriões, a ponta da agulha é normalmente quebrada contra uma lamínula¹⁷. Assim, as agulhas freqüentemente ficam entupidas ou causam vazamento de grandes quantidades de citoplasma e, quando esses problemas surgem, novas agulhas devem ser empregadas. Embora as agulhas de chanfro possam aumentar a eficiência da microinjeção, a solução de moagem entra na ponta chanfrada durante o processo de moagem. A solução de moagem na ponta chanfrada não evapora rapidamente naturalmente; portanto, as agulhas não podem ser utilizadas para microinjeção diretamente após o chanfro. Esses fatores reduzem a eficiência dos procedimentos de microinjeção de embriões. Aqui, usando a transgênese site-specific mediada por phiC31 em Drosophila como exemplo, apresentamos um protocolo de microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila. Para evitar que a solução de moagem entre na agulha, utilizamos uma bomba de ar para exercer pressão de ar dentro da agulha, evitando assim que a solução de moagem entre na ponta chanfrada. As agulhas chanfradas estão prontas para o carregamento da amostra e microinjeção diretamente após o chanfro.