ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション
Summary
この記事では、ショウジョウバエのphiC31インテグラーゼ媒介トランスジェネシスを例に、トランスジェニックフライを作成するための重要なステップである胚マイクロインジェクションの最適化されたプロトコルを紹介します。
Abstract
ショウジョウバエのトランスジェネシスは、生物レベルで遺伝子機能を研究するための重要なアプローチです。胚マイクロインジェクションは、トランスジェニックフライの構築にとって重要なステップです。マイクロインジェクションには、マイクロインジェクター、マイクロマニピュレーター、倒立顕微鏡、実体顕微鏡など、いくつかの種類の機器が必要です。プラスミドミニプレップキットで単離されたプラスミドは、マイクロインジェクションに適しています。核が共通の細胞質を共有する前胚盤葉期または合胞体胚盤葉期の胚は、マイクロインジェクションを受けます。細胞ストレーナーは、胚の解体プロセスを容易にします。胚の解体と乾燥の最適な時期は、実験的に決定する必要があります。胚マイクロインジェクションの効率を高めるためには、プーラーで調製した針をニードルグラインダーで面取りする必要があります。針を研削する工程では、針先の毛細管現象を避けるために、圧力計付きのフットエアポンプを利用します。各プラスミドに対して120〜140個の胚を定期的に注入し、プラスミドの約85%に対して少なくとも1つのトランスジェニックラインを取得します。この記事では、ショウジョウバエのphiC31インテグラーゼ媒介トランスジェネシスを例にとり、ショウジョウバエのトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクションの詳細なプロトコルを紹介します。
Introduction
ショウジョウバエDrosophila melanogasterは、遺伝子操作と遺伝子分析に非常に適しています。トランスジェニックショウジョウバエは、生物学研究で広く使用されています。1980年代初頭に開発されて以来、P-elementトランスポゾンを介したトランスジェネシスはショウジョウバエの研究に不可欠でした1。いくつかのシナリオでは、piggyBacやMinosなどの他のトランスポゾンがショウジョウバエのトランスジェネシスにも使用されています2。トランスポゾンを介した導入遺伝子は、ショウジョウバエのゲノムにランダムに挿入され、異なるゲノム遺伝子座における導入遺伝子の発現レベルは位置効果により異なる場合があり、したがって比較することはできません2。これらの欠点は、phiC31を介した部位特異的トランスジェネシス3によって克服されました3。バクテリオファージphiC31遺伝子は、ショウジョウバエ3のattB部位とattP部位間の配列特異的な組換えを媒介するインテグラーゼをコードしています。多くのattPドッキングサイトが特徴付けられており、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター3,4,5,6,7,8,9で利用できます。
ショウジョウバエのphiC31トランスジェネシスシステムは、ハエコミュニティで広く使用されています。attPドッキング部位のうち、X染色体上のattP18、第2染色体上のattP40、および第3染色体上のattP2は、通常、各染色体上の導入遺伝子統合に適した部位です。なぜなら、3つの部位の導入遺伝子は、基礎発現のレベルが低い一方で、誘導可能な発現のレベルが高いためです5。しかし最近、van der Graafらは、Msp300遺伝子座に近いattP40部位とattP40に統合された導入遺伝子が、ショウジョウバエ10の幼虫の筋核クラスタリングを引き起こすことを発見しました。最近の別の研究では、Duan氏らは、ホモ接合型のattP40染色体が、ショウジョウバエ11のOr47b嗅覚受容体ニューロンクラスの正常な糸球体組織を破壊することを発見しました。これらの知見は、実験を設計し、データを解釈する際には、厳密な管理を含めるべきであることを示唆している。
ショウジョウバエは、ライフサイクルが短く、低コストで、メンテナンスが容易なため、遺伝子機能のin vivo調査に理想的なモデル生物です。ゲノムワイドな遺伝子スクリーニングは、ショウジョウバエ12,13,14,15のゲノムワイドなトランスジェニックライブラリーの構築に依存しています。私たちはこれまでに、Drosophila Genomics Resource Center(DGRC)Gold Collection16でヒトに保存されているショウジョウバエ遺伝子の83%をカバーする、バイナリGAL4/upstream activating sequence(GAL4/UAS)システムに基づく5551のUAS-cDNA/ORFコンストラクトを生成しました。UAS-cDNA/ORFプラスミドは、ショウジョウバエのトランスジェニックUAS-cDNA/ORFライブラリーの作成に使用できます。効率的な胚マイクロインジェクション技術は、トランスジェニックフライライブラリの作成を加速することができます。
胚マイクロインジェクションの場合、針先は通常、カバースリップ17に対して折れている。そのため、針が詰まったり、細胞質が大量に漏れたりすることが多く、これらの問題が発生した場合には、新たな針を用いなければなりません。面取り針はマイクロインジェクションの効率を高めることができますが、研削プロセス中に研削液が面取りされた先端に入ります。斜めの先端の粉砕液は、自然にすぐには蒸発しません。そのため、面取り直後のマイクロインジェクションには針を利用できません。 これらの要因は、胚マイクロインジェクション手順の効率を低下させます。ここでは、 ショウジョウバエ におけるphiC31を介した部位特異的トランスジェネシスを例に、 ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクションのプロトコールを提示する。研削液が針に入らないように、エアポンプで針内に空気圧をかけることで、面取りした先端に研削液が入らないようにしています。面取りされた針は、面取り後すぐにサンプルのローディングとマイクロインジェクションの準備ができています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、 ショウジョウバエのトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクションのプロトコルを紹介します。phiC31を介した部位特異的トランスジェネシスについては、各プラスミドに対して120〜140個の胚を注入し、プラスミドの約85%に対して少なくとも1つのトランスジェニックラインを取得しました(補足表2)。私たちの経験では、ショ ウジョウバエのト?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、南中国大学のハイレベルタレントのための科学研究基金の支援を受けました。
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
References
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. 遗传学. 166 (4), 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
- Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. 遗传学. 173 (2), 769-777 (2006).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
- Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), 1095-1102 (2012).
- Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
- Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).
- Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), 022 (2023).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. 遗传学. 188 (3), 731-743 (2011).
- Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. 遗传学. 214 (4), 755-767 (2020).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
- Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).
