Monitorización de la evolución mecánica del tejido durante el cierre del tubo neural de un embrión de pollo

Los defectos del tubo neural (DTN) son defectos congénitos graves del sistema nervioso central causados por fallos en el cierre del tubo neural (NTC) durante^{el desarrollo} embrionario. La etiología de las enfermedades tropicales desatendidas es compleja. Los estudios han demostrado que el NTC implica una secuencia de procesos morfogenéticos, que incluyen la extensión convergente, la flexión de la placa neural (por ejemplo, la constricción apical), la elevación del pliegue neural y, finalmente, la adhesión del pliegue neural. Estos procesos están regulados por múltiples mecanismos moleculares y genéticos ^2,3, y cualquier mal funcionamiento en estos procesos puede dar lugar a defectos del tubo neural ^4,5,6. Dado que cada vez hay más pruebas que sugieren que las señales mecánicas también desempeñan un papel crucial durante la NTC 3,7,8,9,10,11, y se han encontrado relaciones entre los genes y las señales mecánicas 12,13,14, se hace imperativo investigar la biomecánica tisular durante la neurulación.

Se han desarrollado varias técnicas para medir las propiedades mecánicas de los tejidos embrionarios, entre las que se encuentran la ablación con láser (LA)¹⁵, la disección y relajación de tejidos (TDR)^16,17, la aspiración con micropipetas (MA)¹⁸, la nanoindentación basada en microscopía de fuerza atómica (AFM)¹⁹, los microindentadores (MI) y las microplacas (MP)²⁰, la microrreología (RM) con pinzas ópticas/magnéticas 21,22,23y sensores basados en gotas²⁴. Los métodos existentes pueden medir propiedades mecánicas con resoluciones espaciales que van desde escalas subcelulares hasta tisulares. Sin embargo, la mayoría de estos métodos son invasivos porque requieren contacto con la muestra (p. ej., MA, AFM, MI y MP), inyección de material externo (p. ej., RM y sensores basados en gotas) o disección de tejidos (p. ej., LA y TDR). Como resultado, es un desafío para los métodos existentes monitorear la evolución mecánica del tejido de la placa neural in situ²⁵. Recientemente, la elastografía de coherencia óptica reverberante se ha mostrado prometedora para el mapeo mecánico sin contacto con alta resolución espacial²⁶.

La microscopía confocal de Brillouin es una modalidad óptica emergente que permite la cuantificación sin contacto de la biomecánica tisular con resolución subcelular 27,28,29,30. La microscopía de Brillouin se basa en el principio de dispersión espontánea de la luz de Brillouin, que es la interacción entre la luz láser incidente y la onda acústica inducida por las fluctuaciones térmicas dentro del material. En consecuencia, la luz dispersa experimenta un cambio de frecuencia, conocido como desplazamiento de Brillouin ω_R, siguiendo la ecuación³¹:

(1)

Aquí, es el índice de refracción del material, λ es la longitud de onda de la luz incidente, M’ es el módulo longitudinal, ρ es la densidad de masa y θ es el ángulo entre la luz incidente y la luz dispersa. Para el mismo tipo de materiales biológicos, la relación entre el índice de refracción y la densidad es aproximadamente constante 28,32,33,34,35,36. Por lo tanto, el desplazamiento de Brillouin se puede utilizar directamente para estimar los cambios mecánicos relativos en los procesos fisiológicos. La factibilidad de la microscopía de Brillouin ha sido validada en diversas muestras biológicas 29,37,38. Recientemente, se demostró la obtención de imágenes mecánicas de lapso de tiempo de un embrión de pollito vivo mediante la combinación de un microscopio Brillouin con un sistema de incubación en el escenario³⁹. Este protocolo proporciona descripciones detalladas de la preparación de la muestra, la implementación del experimento y el posprocesamiento y análisis de los datos. Esperamos que este esfuerzo facilite la adopción generalizada de la tecnología Brillouin sin contacto para estudiar la regulación biomecánica en el desarrollo embrionario y los defectos congénitos.