ニワトリ胚の神経管閉鎖中の組織の機械的進化のモニタリング

神経管欠損症(NTD)は、胚発生中の神経管閉鎖(NTC)の障害によって引き起こされる中枢神経系の重篤な先天性欠損症です¹。NTDsの病因は複雑です。研究によると、NTCには、収束伸長、神経板の曲げ(例えば、頂端収縮)、神経襞の上昇、そして最後に神経襞の接着を含む一連の形態形成プロセスが含まれます。これらのプロセスは、複数の分子的および遺伝的メカニズムによって制御されており^2,3、これらのプロセスに異常が生じると、NTDs4,5,6が発生する可能性があります。NTC ^{3,7,8,9,10,11}の間、機械的な手がかりも重要な役割を果たしていることを示唆する証拠が増えており、遺伝子と機械的な手がかり^12,13,14の間に関係が見出されているため、神経形成中の組織バイオメカニクスを調査することが不可欠になります。

胚組織の機械的特性を測定するために、レーザーアブレーション(LA)¹⁵、組織解剖および弛緩(TDR)^16,17、マイクロピペット吸引(MA)¹⁸、原子間力顕微鏡(AFM)ベースのナノインデンテーション¹⁹、マイクロインデンター(MI)およびマイクロプレート(MP)²⁰、光/磁気ピンセットによるマイクロレオロジー(MR)^21,22,23など、いくつかの技術が開発されています、及び液滴ベースのセンサ²⁴。既存の方法では、細胞内スケールから組織スケールまでの空間分解能で機械的特性を測定できます。しかし、これらの方法のほとんどは、サンプルとの接触(MA、AFM、MI、MPなど)、外部材料注入(MRや液滴ベースのセンサーなど)、または組織解剖(LAやTDRなど)を必要とするため、侵襲的です。その結果、既存の方法では、神経板組織の機械的進化をin situでモニターすることは困難である²⁵。最近、残響光コヒーレンスエラストグラフィは、高い空間分解能を持つ非接触メカニカルマッピングに有望であることが示されている²⁶。

共焦点ブリルアン顕微鏡は、細胞内分解能^27,28,29,30で組織バイオメカニクスの非接触定量を可能にする新しい光学モダリティです。ブリルアン顕微鏡は、入射レーザー光と材料内の熱揺らぎによって引き起こされる音波との相互作用である自発的ブリルアン光散乱の原理に基づいています。その結果、散乱光は、式³¹に従って、ブリルアンシフト_ωRとして知られる周波数シフトを経験します。

(1)

ここで、 は材料の屈折率、 λ は入射光の波長、 M’は縦弾性率、 ρ は質量密度、 θ は入射光と散乱光との角度です。同じ種類の生体材料の場合、屈折率と密度の比率はほぼ一定です^{28、32、33、34、35、36}。したがって、ブリルアンシフトは、生理学的プロセスにおける相対的な機械的変化を推定するために直接使用できます。ブリルアン顕微鏡の実現可能性は、さまざまな生物学的サンプルで検証されています^29,37,38。最近、生きたニワトリ胚のタイムラプス機械的イメージングが、ブリルアン顕微鏡とステージ上のインキュベーションシステム³⁹との組み合わせによって実証された。このプロトコルでは、サンプル調製、実験の実施、およびデータの後処理と分析について詳しく説明します。この取り組みにより、胚発生や先天性欠損症の生体力学的調節を研究するための非接触ブリルアン技術の普及が促進されることを願っています。