Summary

Modelo de metástasis de ganglios linfáticos de drenaje para evaluar la dinámica de las células T CD8+ específicas del antígeno durante la tumorigénesis

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

El diseño experimental presentado aquí proporciona un modelo reproductivo útil para los estudios de células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de ganglios linfáticos (LN), que excluye la perturbación de las células T CD8+ espectadoras.

Abstract

Las células T CD8+ específicas del antígeno tumoral de los ganglios linfáticos drenantes adquieren una importancia acumulativa en el montaje de la respuesta inmunitaria antitumoral durante la tumorigénesis. Sin embargo, en muchos casos, las células cancerosas forman loci metastásicos en los ganglios linfáticos antes de seguir haciendo metástasis en órganos distantes. No se sabe hasta qué punto las respuestas locales y sistemáticas de las células T CD8+ se vieron influidas por la metástasis de la LN. Con este fin, establecimos un modelo murino de metástasis LN combinado con una línea celular de melanoma B16F10-GP que expresa el neoantígeno sustituto derivado del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), la glicoproteína (GP) y los ratones transgénicos P14 que albergan receptores de células T (TCR) específicos del péptido derivado de GP GP33-41 presentado por la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I H-2Db. Este protocolo permite el estudio de las respuestas de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno durante la metástasis de LN. En este protocolo, a los ratones C57BL/6J se les implantaron por vía subcutánea células B16F10-GP, seguidas de una transferencia adoptiva con células P14 vírgenes. Cuando el tumor subcutáneo creció hasta aproximadamente 5 mm de diámetro, se extirpó el tumor primario y se inyectaron células B16F10-GP directamente en el ganglio linfático que drena el tumor (TdLN). A continuación, se monitorizó la dinámica de los linfocitos T CD8+ durante el proceso de metástasis de LN. En conjunto, este modelo ha proporcionado un enfoque para investigar con precisión las respuestas inmunitarias de las células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de LN.

Introduction

La inmunoterapia contra el cáncer, especialmente el bloqueo de puntos de control inmunitario (BCI), ha revolucionado la terapia contra el cáncer1. El BCI bloquea los inmunorreceptores coinhibidores (como PD-1, Tim-3, LAG-3 y TIGIT), que se expresan en gran medida en los linfocitos T CD8+ agotados en el microambiente tumoral (TME), lo que conduce a la revitalización de los linfocitos T CD8+ agotados2. Teniendo en cuenta la heterogeneidad de los linfocitos T CD8+ agotados, la evidencia acumulada reveló que los linfocitos T CD8+ específicos del tumor derivados de la periferia, incluido el ganglio linfático de drenaje (dLN), pero no en el TME, median la eficacia de la BCI 3,4,5,6,7,8. Recientemente, se confirmó que las células T CD8+ de memoria específicas para tumores TCF-1+TOX derivadas de TdLN (TdLN-T TSM) son las que responden genuinamente a la ICB, que incorporan varias propiedades funcionales de las células T de memoria convencionales y podrían expandirse y diferenciarse aún más en células agotadas de la progenie tras el tratamiento con ICB9. En conjunto, estos hallazgos corroboraron la importancia de la LN en el aumento de la inmunidad antitumoral.

Los ganglios linfáticos funcionan como un lugar crítico para facilitar el cebado y la activación de las células T CD8+ específicas del tumor al proporcionar una base estructural y señales biológicas10. Varios tipos de células cancerosas siembran con frecuencia el ganglio linfático centinela (GLC, el primer LN que drena un tumor primario) antes de la diseminación sistemática11. La presencia de metástasis en el GLC se relaciona con un pronóstico precario en el cáncer humano y los modelos preclínicos mostraron que las células tumorales en la NTdLN podrían diseminarse a órganos distantes a través de los vasos linfáticos y los vasos sanguíneos del ganglio 12,13,14,15. La biopsia de GLC ahora representa un procedimiento estándar para guiar las decisiones de tratamiento posteriores en muchos tipos de tumores sólidos, lo que podría evitar la resección innecesaria de LNno comprometida 16,17. Incluso para la LN afectada, sigue siendo controvertido si es necesaria la resección quirúrgica y cuándo, ya que varios estudios han demostrado que la extirpación de la LN regional no mostró una mejora de la supervivencia global en comparación con aquellos que recibieron radioterapia o terapia sistémica sin resección de la LN regional18,19. Una interpretación es que la LN metastásica (mLN) con enfermedad microscópica puede conservar cierta capacidad para educar a las células inmunitarias y proporcionar algunos beneficios terapéuticos. Por lo tanto, es de vital importancia dilucidar cómo la metástasis de LN afecta la respuesta inmune antitumoral, especialmente las propiedades y funciones de TdLN-TTSM.

Hasta ahora, tanto los datos preclínicos como los clínicos han revelado algunas alteraciones estructurales y celulares en mLN20. Sin embargo, no se han delineado los cambios dinámicos de las células T CD8+ específicas del tumor durante la metástasis de la LN. Por lo tanto, es necesario desarrollar un modelo convincente de metástasis de LN para futuras investigaciones. De hecho, varios estudios han reportado modelos de mLN en ratones a través de diferentes vías 14,21,22. Por ejemplo, la metástasis espontánea en las LN axilares se llevó a cabo mediante la implantación de células de cáncer de mama 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria22. En otro estudio, Reticker-Flynn et al. generaron líneas celulares de melanoma con alta incidencia de diseminación desde el tumor primario subcutáneo a las LN mediante la inoculación seriada de células tumorales cultivadas a partir de tejidos mLN disociados (nueve rondas)14. Otro modelo comúnmente utilizado se preparó mediante la inyección de células tumorales en la almohadilla del pie y los loci metastásicos se formarían en LN22 poplítea. En particular, es difícil evaluar los puntos temporales precisos de intervención porque la metástasis de LN en estos modelos no siempre es fiel.

En el presente estudio, se estableció un modelo murino de LN metastásico a través de la inyección intraganglionar de células B16F10-GP23,24, generadas por la inserción mediada por CRISPR/Cas9 de la secuencia génica de la glicoproteína (GP) del virus LCMV en el genoma de la línea celular B16F109. A continuación, estos ratones fueron transferidos con células P14 que albergan receptores de células T transgénicas (TCR) que reconocen específicamente el epítopo H-2Db GP33-41 25,26 y se pudo investigar la dinámica sistémica y local de las células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de LN. Nuestro diseño experimental proporciona un modelo útil para el estudio de las respuestas inmunes, especialmente de las células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de LN, lo que excluye la perturbación de las células T CD8+ espectadoras. Estos resultados afectarían a las opciones de tratamiento clínico de si se debe eliminar o retener la mLN y arrojarían nueva luz sobre la manipulación de la mLN para lograr los máximos beneficios terapéuticos.

Protocol

Los ratones C57BL/6J (referidos a ratones B6) y los ratones transgénicos P14 naïve 9,27 utilizados tenían entre 6 y 10 semanas de edad y pesaban entre 18 y 22 g. Tanto el sexo masculino como el femenino se incluyeron sin aleatorización ni cegamiento. Todos los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Qingdao. 1….

Representative Results

El diagrama esquemático de este diseño experimental se muestra en la Figura 1A. Un total de 5 x 105 células B16F10-GP en 100 μL de PBS se implantaron por vía subcutánea (s.c.) en la región inguinal bilateral de ratones CD45.2 C57BL/6J. Después de 7 días, estos ratones portadores de tumores fueron inyectados por vía intraperitoneal (i.p.) con 4 mg de CTX, seguido de la transferencia adoptiva de 5 x 105 células CD45.1+P14 a través de la inyección i…

Discussion

Durante la tumorigénesis, las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) engullen a los antígenos tumorales y migran a TdLN, donde preparan las células T CD8+. Después del cebado y la activación, las células T CD8+ abandonan la TdLN y se infiltran en el tumor para destruir las células tumorales. A través de la resección de TdLN y la administración de FTY720 que bloquea la salida de las células inmunitarias de los órganos linfoides, vario…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias para Jóvenes Académicos Sobresalientes de China (n.º 82122028 a LX), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º 82173094 a LX), la Fundación de Ciencias Naturales de Chong Qing (n.º 2023NSCQ-BHX0087 a SW).

Materials

1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences  320310
15 mL conical tube  BEAVER  43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)  Sigma  T48402-25G 
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML 
70 μm nylon cell strainer BD Falcon  352350
APC anti-mouse CD45.1  BioLegend  110714 Clone:A20 
B16-GP cell line Beijing Biocytogen Co.Ltd, China Custom
BSA-V (bovine serum albumin)  Bioss bs-0292P
cell culture dish BEAVER  43701/43702/43703 
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R 
cyclophosphamide Sigma  C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX) Sigma PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium  Gibco  C11995500BT 
EDTA Sigma EDS-500g 
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum  Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science  R510-22-16 
KHCO3  Sangon Biotech  A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation  Life Technologies  L10199 
needle carrier  RWD Life Science  F31034-14 
NH4Cl  Sangon Biotech A501569-0500 
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a  BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002 
surgical forceps RWD Life Science  F12005-10
surgical scissors RWD Life Science  S12003-09 
suture thread RWD Life Science F34004-30 
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

References

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Zhang, Y., Su, X., Wang, L., Yue, Z., Liu, Q., Ran, L., Lei, S., Hu, J., Xu, L., Ye, L., Ji, P., Li, G., Huang, Q., Wen, S. Draining Lymph Node Metastasis Model for Assessing the Dynamics of Antigen-Specific CD8+ T Cells During Tumorigenesis. J. Vis. Exp. (203), e65646, doi:10.3791/65646 (2024).

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