Summary

Модель метастазирования дренирующих лимфатических узлов для оценки динамики антиген-специфических CD8+ Т-клеток в процессе онкогенеза

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

Представленный здесь дизайн эксперимента представляет собой полезную репродуктивную модель для изучения антиген-специфических CD8+ Т-клеток при метастазировании в лимфатические узлы (ВН), которая исключает возмущение CD8+ Т-клеток.

Abstract

CD8+ Т-клетки опухолевого антигена из дренирующих лимфатических узлов приобретают все большее значение в формировании противоопухолевого иммунного ответа в процессе онкогенеза. Однако во многих случаях раковые клетки образуют метастатические локусы в лимфатических узлах перед дальнейшим метастазированием в отдаленные органы. В какой степени метастазы ЛН влияли на локальный и систематический ответ CD8+ Т-клеток, остается неясным. С этой целью мы создали мышиную модель метастазирования LN в сочетании с клеточной линией меланомы B16F10-GP, экспрессирующей суррогатный неоантиген, полученный из вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), гликопротеина (GP) и P14 трансгенных мышей, содержащих рецепторы Т-клеток (TCR), специфичные к пептиду GP33-41 , полученному из GP, представленному молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I H-2Db. Этот протокол позволяет изучать антиген-специфический ответ CD8+ Т-клеток при метастазировании ВН. В рамках этого протокола мышам C57BL/6J подкожно имплантировали клетки B16F10-GP с последующим адоптивным переносом наивными клетками P14. Когда подкожная опухоль достигала примерно 5 мм в диаметре, первичную опухоль иссекали, а клетки B16F10-GP вводили непосредственно в опухоль дренирующий лимфатический узел (TdLN). Затем контролировали динамику CD8+ Т-клеток в процессе метастазирования ВН. В совокупности эта модель обеспечила подход к точному исследованию антиген-специфического иммунного ответа CD8+ Т-клеток во время метастазирования ВН.

Introduction

Иммунотерапия рака, особенно блокада контрольных точек иммунного ответа (ICB), произвела революциюв терапии рака1. ICB блокирует коингибирующие иммунорецепторы (такие как PD-1, Tim-3, LAG-3 и TIGIT), которые высоко экспрессируются в истощенных CD8+ Т-клетках в опухолевом микроокружении (TME), что приводит к оживлению истощенных CD8+ Т-клеток2. Учитывая гетерогенность истощенных CD8+ Т-клеток, накопление доказательств показало, что опухолеспецифичные CD8+ Т-клетки, полученные с периферии, включая дренирующий лимфатический узел (dLN), но не в TME, опосредуют эффективность ICB 3,4,5,6,7,8. Недавно было подтверждено, что полученные из TdLN TCF-1+TOX опухолеспецифичные CD8+ Т-клетки памяти (TdLN-TTSM) являются подлинными ответителями на ICB, которые воплощают в себе несколько функциональных свойств обычных Т-клеток памяти и могут в дальнейшем расширяться и дифференцироваться в истощенные клетки потомства при лечении ICB9. В целом, эти результаты подтвердили важность ЛН в формировании противоопухолевого иммунитета.

Лимфатические узлы функционируют как важнейшее место в содействии праймингу и активации опухолеспецифичных CD8+ Т-клеток, обеспечивая структурную основу, а также биологические сигналы10. Некоторые типы раковых клеток часто засеивают сторожевые лимфатические узлы (SLN, первый LN, дренирующий первичную опухоль) перед систематической диссеминацией11. Наличие метастазов SLN связано с плохим исходом при раке человека, и доклинические модели показали, что опухолевые клетки в TdLN могут распространяться в отдаленные органы как через лимфатические сосуды, так и через кровеносные сосуды узла 12,13,14,15. Биопсия SLN в настоящее время представляет собой стандартную процедуру для принятия последующих решений о лечении многих типов солидных опухолей, что позволяет избежать ненужной резекции непораженного LN16,17. Даже для пациентов с ВН остается спорным вопрос о том, нужна ли хирургическая резекция, и если да, то когда, поскольку несколько исследований показали, что удаление регионарной ВН не продемонстрировало улучшения общей выживаемости по сравнению с теми, кто получал лучевую или системную терапию без регионарной резекции ВН18,19. Одна из интерпретаций заключается в том, что метастатическая ВН (мЛН) с микроскопическим заболеванием может сохранять некоторую способность обучать иммунные клетки и обеспечивать некоторые терапевтические преимущества. Таким образом, критически важно выяснить, как метастазы ЛН влияют на противоопухолевый иммунный ответ, особенно на свойства и функции TdLN-TTSM.

До сих пор как доклинические, так и клинические данные выявили некоторые структурные и клеточные изменения в mLN20. Однако динамические изменения опухолеспецифичных CD8+ Т-клеток при метастазировании ЛН не очерчены. Поэтому для дальнейшего изучения необходима разработка убедительной модели метастазирования ВН. Действительно, в нескольких исследованиях сообщалось о моделях mLN на мышах различными способами 14,21,22. Например, спонтанное метастазирование в подмышечных ЛУ проводили путем имплантации клеток рака молочной железы 4Т1 в жировую подушкумолочной железы 22. В другом исследовании Reticker-Flynn et al. создали клеточные линии меланомы с высокой частотой распространения от подкожной первичной опухоли к ВН путем последовательной инокуляции опухолевых клеток, культивируемых из диссоциированных тканей mLN (девять раундов)14. Другая широко используемая модель была получена путем инъекции опухолевых клеток в подушечку стопы, и метастатические локусы образовывались в подколенной LN22. Примечательно, что трудно оценить точные сроки вмешательства, поскольку метастазы ВН в этих моделях не всегда точны.

В настоящем исследовании мышиная метастатическая модель LN была создана путем интранодальной инъекции клеток B16F10-GP23,24, полученных путем CRISPR/Cas9-опосредованной вставки последовательности гена гликопротеина (GP) вируса LCMV в геном клеточной линии9 B16F10. Затем этим мышам были пересажены клетки P14, которые содержат трансгенные Т-клеточные рецепторы (TCR), специфически распознающие эпитоп H-2Db GP33-41 25,26, и можно было исследовать системную и локальную динамику антиген-специфических CD8+ Т-клеток при метастазировании ЛН. Наш экспериментальный дизайн представляет собой полезную модель для изучения иммунных реакций, особенно антиген-специфических CD8+ Т-клеток во время метастазирования ЛН, что исключает возмущение CD8+ Т-клеток. Эти результаты повлияют на варианты клинического лечения, связанные с удалением или сохранением mLN, и прольют новый свет на манипуляции с mLN для достижения максимального терапевтического эффекта.

Protocol

Мыши C57BL/6J (относящиеся к мышам B6) и наивные трансгенные мышиP14 9,27 были в возрасте 6-10 недель с массой тела 18-22 г. Как мужчины, так и женщины были включены в исследование без рандомизации или ослепления. Все исследования на животных проводились в соответствии…

Representative Results

Принципиальная схема этого экспериментального проекта показана на рисунке 1А. В общей сложности 5 x 105 клеток B16F10-GP в 100 мкл PBS были подкожно имплантированы в двустороннюю паховую область мышей CD45.2 C57BL/6J. Через 7 дней этим мышам с опухолью внутривенно (в/в) вводили 4 мг CT…

Discussion

Во время онкогенеза антигенпрезентирующие клетки (APC) поглощают опухолевые антигены и мигрируют в TdLN, где они праймируют CD8+ Т-клетки. После прайминга и активации CD8+ Т-клетки покидают TdLN и проникают в опухоль, убивая опухолевые клетки10. Благодаря резекции TdLN и вве…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом выдающихся молодых ученых Китая (No 82122028 – LX), Национальным фондом естественных наук Китая (No 82173094 – LX), Фондом естественных наук Чун Цина (No 2023NSCQ-BHX0087 to SW).

Materials

1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences  320310
15 mL conical tube  BEAVER  43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)  Sigma  T48402-25G 
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML 
70 μm nylon cell strainer BD Falcon  352350
APC anti-mouse CD45.1  BioLegend  110714 Clone:A20 
B16-GP cell line Beijing Biocytogen Co.Ltd, China Custom
BSA-V (bovine serum albumin)  Bioss bs-0292P
cell culture dish BEAVER  43701/43702/43703 
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R 
cyclophosphamide Sigma  C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX) Sigma PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium  Gibco  C11995500BT 
EDTA Sigma EDS-500g 
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum  Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science  R510-22-16 
KHCO3  Sangon Biotech  A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation  Life Technologies  L10199 
needle carrier  RWD Life Science  F31034-14 
NH4Cl  Sangon Biotech A501569-0500 
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a  BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002 
surgical forceps RWD Life Science  F12005-10
surgical scissors RWD Life Science  S12003-09 
suture thread RWD Life Science F34004-30 
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

References

  1. Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
  2. Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
  3. Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
  4. Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  5. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
  6. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
  7. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
  8. Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
  9. Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
  10. Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
  11. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
  12. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  13. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  14. Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
  15. Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
  16. Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
  17. Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
  18. Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
  19. Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
  20. du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
  21. An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
  22. Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
  23. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
  25. Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
  26. Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
  27. Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
  28. North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
  29. Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
  30. Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
  31. Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
  32. Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
  33. Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
  34. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
  35. Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
  36. Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Su, X., Wang, L., Yue, Z., Liu, Q., Ran, L., Lei, S., Hu, J., Xu, L., Ye, L., Ji, P., Li, G., Huang, Q., Wen, S. Draining Lymph Node Metastasis Model for Assessing the Dynamics of Antigen-Specific CD8+ T Cells During Tumorigenesis. J. Vis. Exp. (203), e65646, doi:10.3791/65646 (2024).

View Video