RGBradford: Cuantificación de proteínas con la cámara de un teléfono inteligente

Independientemente del uso posterior (por ejemplo, ELISA, cinética enzimática, Western blot, purificación de proteínas y espectrometría de masas), la cuantificación de proteínas es crucial para un análisis preciso en los laboratorios de ciencias de la vida. Además de su uso como lecturas secundarias (es decir, para calcular los niveles relativos de analitos por masa de proteína), los niveles de proteína en una muestra también pueden ser el resultado deseado en sí mismo. Por ejemplo, uno puede estar interesado en los niveles de proteínas en los recursos alimenticios¹ o en la orina². Hay muchos métodos disponibles para medir la concentración de proteínas en las muestras³, incluidas las lecturas directas de absorbancia UV⁴, la quelación proteína-cobre ^5,6, los ensayos colorimétricos de unión proteína-colorante⁷ y los ensayos fluorescentes de unión proteína-colorante⁸. La relevancia de la cuantificación de proteínas se evidencia por la presencia de dos artículos que describen métodos de medición de proteínas ^5,7 en el top-3 de la literatura más citada ^9,10. A pesar del hecho de que muchos autores descuidan su cita real citando referencias no primarias o no citando nada en absoluto, los artículos originales que describen el ensayo de proteína de Lowry y el ensayo de proteína de Bradford suman >200,000 citas cada¹⁰.

La popularidad del ensayo Bradford se debe a su asequibilidad, simplicidad, velocidad y sensibilidad. El ensayo se basa en la interacción entre las proteínas y el colorante Coomassie Brilliant Blue G en condiciones ácidas. En las condiciones del ensayo (es decir, pH bajo), el colorante existe en tres formas: una forma catiónica roja con λmax a 470 nm; una forma neutra verde con λmax a 650 nm; y una forma aniónica azul con λmax a 590 nm^11,12 (Figura 1). La forma catiónica predomina en ausencia de proteínas. A medida que las proteínas interactúan con el colorante, estabilizan la forma aniónica azul, lo que provoca un cambio notable en el color de la solución, de marrón a azul. Por lo general, el cambio en la concentración de la forma azul del colorante se cuantifica espectrofotométricamente, cuya absorbancia a 590-595 nm es proporcional a la cantidad de proteína en el ensayo.

Figura 1: Espectros de absorción G azul brillante de Coomassie bajo las condiciones del ensayo Bradford. Los tres picos principales están marcados con flechas que indican el λmax de las formas roja (470 nm), verde (650 nm) y azul (590 nm) del tinte. Los espectros se registraron en ausencia de proteína (línea amarilla) y en presencia de 3 μg (línea gris) y 10 μg (línea azul) de albúmina sérica bovina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El uso generalizado del ensayo de Bradford ha llevado a la identificación de varias limitaciones (p. ej., respuestas variables a diferentes proteínas¹¹ e interferencia de lípidos¹³ y detergentes⁷) y al desarrollo de modificaciones para mejorar su rendimiento (p. ej., la adición de detergentes ^14,15, alcalinización^14,16 y el uso de la relación de absorbancias¹⁷). Además de las modificaciones en el propio ensayo, también se ha descrito el uso de dispositivos alternativos, como teléfonos inteligentes o cámaras, para capturar señales analíticas 18,19,20. De hecho, el desarrollo de métodos que hacen uso de teléfonos inteligentes como analizadores químicos portátiles ha sido un área activa de investigación. La motivación para el uso de teléfonos inteligentes se deriva de la asequibilidad, portabilidad, facilidad de uso y amplia disponibilidad de estos dispositivos.

Este artículo proporciona un protocolo para la cuantificación de proteínas utilizando el ensayo RGBradford²⁰, que utiliza un teléfono inteligente como dispositivo analítico. A diferencia de la publicación original de RGBradford²⁰, aquí se ha introducido un procedimiento que agiliza el proceso de extracción de color. Implica la utilización de una aplicación de software disponible gratuitamente para extraer automáticamente la información de color de cada pocillo de una imagen de microplaca, lo que ahorra mucho tiempo y esfuerzo. Esta es una alternativa al método anterior de adquirir manualmente los datos de color de cada pocillo uno por uno utilizando una aplicación de software de edición de gráficos²⁰. En última instancia, los niveles de proteínas en las muestras se pueden cuantificar utilizando datos de color extraídos de una imagen de una microplaca tomada con un teléfono inteligente.