RGBradford: 스마트폰 카메라를 이용한 단백질 정량 분석
Summary
이 논문은 Bradford 분석과 스마트폰을 분석 장치로 사용하여 단백질 정량화를 위한 프로토콜을 제공합니다. 샘플의 단백질 수준은 스마트폰으로 촬영한 마이크로플레이트 사진에서 추출한 색상 데이터를 사용하여 정량화할 수 있습니다.
Abstract
단백질 정량 분석은 생명 과학 연구에서 필수적인 절차입니다. 다른 여러 방법 중에서 Bradford 분석은 가장 많이 사용되는 방법 중 하나입니다. 널리 퍼져 있기 때문에 Bradford 분석의 한계와 장점은 성능을 개선하기 위해 원래 방법의 몇 가지 수정을 포함하여 철저하게 보고되었습니다. 원래 방법의 변경 사항 중 하나는 스마트폰 카메라를 분석 도구로 사용하는 것입니다. 이 논문은 Bradford 분석의 조건에 존재하는 세 가지 형태의 Coomassie Brilliant Blue 염료를 활용하여 마이크로플레이트의 단일 사진에서 추출한 색상 데이터를 사용하여 샘플의 단백질을 정확하게 정량화하는 방법을 설명합니다. 마이크로플레이트에서 분석을 수행한 후 스마트폰 카메라를 사용하여 사진을 촬영하고 무료 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 사진에서 RGB 색상 데이터를 추출합니다. 그런 다음 단백질 농도를 알 수 없는 샘플의 청색 대 녹색 강도 비율(RGB 척도)을 사용하여 표준 곡선을 기반으로 단백질 함량을 계산합니다. RGB 색상 데이터를 사용하여 계산된 값과 기존 흡광도 데이터를 사용하여 계산된 값 사이에는 유의미한 차이가 관찰되지 않습니다.
Introduction
다운스트림 사용(예: ELISA, 효소 역학, 웨스턴 블로팅, 단백질 정제 및 질량 분석법)에 관계없이 단백질 정량화는 생명 과학 실험실의 정확한 분석에 매우 중요합니다. 2차 판독(즉, 단백질 질량당 분석물의 상대적 수준을 계산하기 위해)으로 사용하는 것 외에도 샘플의 단백질 수준은 원하는 출력 자체가 될 수도 있습니다. 예를 들어, 음식물 자원1 또는 소변2의 단백질 수치에 관심을 가질수 있다. 직접 UV 흡광도 판독 값4, 단백질-구리 킬레이트화 5,6, 단백질 염료 결합 비색 분석7 및 단백질 염료 결합 형광 분석8을 포함하여 샘플3에서 단백질 농도를 측정하는 데 사용할 수 있는 많은 방법이 있습니다. 단백질 정량의 관련성은 가장 많이 인용된 문헌 9,10의 상위 3개 문헌에 단백질 측정 방법 5,7을 설명하는 두 개의 논문이 있음으로써 입증됩니다. 많은 저자들이 1차 문헌이 아닌 문헌을 인용하거나 전혀 인용하지 않음으로써 실제 인용을 소홀히 하고 있음에도 불구하고, Lowry 단백질 분석과 Bradford 단백질 분석을 설명하는 원본 논문은 각각10>200,000회 인용)에 달합니다.
Bradford 분석의 인기는 경제성, 단순성, 속도 및 감도에서 비롯됩니다. 이 분석은 산성 조건에서 단백질과 염료 Coomassie Brilliant Blue G 간의 상호 작용을 기반으로 합니다. 분석 조건(즉, 낮은 pH)에서 염료는 세 가지 형태로 존재합니다: 470nm에서 λmax를 갖는 적색 양이온 형태; 650nm에서 λmax를 갖는 녹색 중성 형태; 및 590nm에서 λmax를 갖는 청색 음이온 형태11,12 (그림 1). 양이온 형태는 단백질이 없을 때 우세합니다. 단백질이 염료와 상호 작용할 때 청색 음이온 형태를 안정화시켜 용액의 색상이 갈색에서 파란색으로 눈에 띄게 변합니다. 일반적으로 염료의 청색 형태 농도 변화는 분광 광도계로 정량화되며, 590-595nm에서의 흡광도는 분석의 단백질 양에 비례합니다.
그림 1: Bradford 분석 조건에서 Coomassie 브릴리언트 블루 G 흡수 스펙트럼. 3개의 주요 피크는 염료의 빨간색(470nm), 녹색(650nm) 및 파란색(590nm) 형태의 λmax를 나타내는 화살표로 표시됩니다. 스펙트럼은 단백질(황색 선)이 없는 경우 및 3μg(회색 선) 및 10μg(청색 선)의 소 혈청 알부민이 있는 경우 기록되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Bradford 분석법의 광범위한 사용은 몇 가지 한계(예: 상이한 단백질11에 대한 다양한 반응, 지질13 및 세제7에 의한 간섭)의 확인과 그 성능을 향상시키기 위한 변형의 개발(예: 세제(14,15)의 첨가, 알칼리화(14,16) 및 흡광도(17)의 비율의 사용)을 개발하게 하였다 ). 분석 자체의 수정 외에도 분석 신호를 캡처하기 위해 스마트폰 또는 카메라와 같은 대체 장치를 사용하는 것도 설명되었습니다 18,19,20. 실제로 스마트폰을 휴대용 화학 분석기로 사용하는 방법의 개발은 활발한 연구 분야였습니다. 스마트폰 사용의 동기는 이러한 장치의 경제성, 휴대성, 사용 편의성 및 광범위한 가용성에서 비롯됩니다.
이 논문은 스마트폰을 분석 장치로 사용하는 RGBradford assay20을 사용하여 단백질 정량을 위한 프로토콜을 제공합니다. 원래 RGBradford 간행물20과 달리 여기서는 색상 추출 프로세스를 간소화하는 절차가 도입되었습니다. 여기에는 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어 응용 프로그램을 활용하여 마이크로플레이트 그림의 각 웰에서 색상 정보를 자동으로 추출하여 상당한 시간과 노력을 절약하는 것이 포함됩니다. 이것은 그래픽 편집기 소프트웨어 애플리케이션(20)을 사용하여 각 웰로부터 하나씩 수동으로 색상 데이터를 획득하는 이전 방법의 대안이다. 궁극적으로 샘플의 단백질 수준은 스마트폰으로 촬영한 마이크로플레이트 사진에서 추출한 색상 데이터를 사용하여 정량화할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 스마트폰 카메라를 사용하여 Bradford 단백질 분석의 데이터를 기록하고, 색상 데이터를 추출하고, 최근20년에 설명된 대로 생물학적 샘플의 단백질 수준을 정확하게 정량화하는 방법인 RGBradford에 대해 설명합니다. 본래의 RGBradford 방법과의 한 가지 차이점은 여기서는 ImageJ 플러그인(22 )을 사용하여 색상 데이터를 자동으로 획득하는 절차가 사용되었다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 브라질 국립과학기술개발위원회(CNPq)[보조금 번호 428048/2018-8 및 402556/2022-4]와 브라질리아 대학교(브라질)의 자금 지원을 받았습니다. 저자는 이 연구에 사용된 스마트폰에 대한 액세스를 제공한 Duarte Nuno Carvalho 박사와 Evelyn Santos 박사(i3s, Porto, Portugal)에게 감사를 표합니다.
Materials
| 96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates | Jet Biofil, Guangzhou, China | TCP011096 | Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2153 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B0770 | |
| Ethyl alcohol | |||
| iPhone 11 | Apple | MWM02BR/A | Can be substituted with other smartphone equiped with a camera |
| iPhone 14 Pro | Apple | N/A | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 695017 | |
| Redmi Note 9 Pro | XIAOMI | N/A | |
| S22 Ultra | Samsung | N/A | |
| SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. | Molecular Devices, San Jose, CA | PLUS 384 | Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader. |
References
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