במבחנה מיפוי כימי של מבני DNA G-Quadruplex על ידי bis-3-chloropiperidines
Summary
Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) הן בדיקות כימיות שימושיות לזיהוי ואפיון מבני G-quadruplex בתבניות DNA במבחנה. פרוטוקול זה מפרט את ההליך לביצוע תגובות חיטוט עם B-CePs ולפתרון תוצרי תגובה על ידי אלקטרופורזה של ג’ל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה.
Abstract
G-quadruplexes (G4s) הם מבני DNA רלוונטיים ביולוגית, לא קנוניים, הממלאים תפקיד חשוב בביטוי גנים ובמחלות, ומייצגים מטרות טיפוליות משמעותיות. נדרשות שיטות נגישות לאפיון במבחנה של DNA בתוך רצפים פוטנציאליים יוצרי G-quadruplex (PQS). B-CePs הם סוג של סוכני אלקילציה שהוכחו כבדיקות כימיות שימושיות לחקר המבנה מסדר גבוה יותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר בדיקת מיפוי כימית חדשה המנצלת את התגובתיות הספציפית של B-CePs עם N7 של גואנינים, ואחריה פיצול גדילים ישיר ב-Gs האלקילציה.
כלומר, כדי להבדיל בין קפלי G4 לבין צורות דנ”א פתוחות, אנו משתמשים ב-B-CeP 1 כדי לחקור את האפטמר קושר התרומבין (TBA), דנ”א של 15 מר המסוגל להניח את סידור G4. תגובה של גואנינים מגיבי B-CeP עם B-CeP 1 מניבה מוצרים שניתן לפתור על ידי אלקטרופורזה של ג’ל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה (PAGE) ברמת נוקלאוטיד יחיד על ידי איתור צינורות אלקילציה בודדים ומחשוף גדילי DNA בגואנינים האלקילטים. מיפוי באמצעות B-CePs הוא כלי פשוט ורב-עוצמה לאפיון במבחנה של רצפי DNA יוצרי G-quadruplex, המאפשר מיקום מדויק של גואנינים המעורבים בהיווצרות G-tetrads.
Introduction
בנוסף לסליל הכפול הטיפוסי של ווטסון-קריק, חומצות גרעין יכולות לאמץ מבנים משניים שונים, כגון צורת G-quadruplex (G4) החלופית, בשל הרצפים העשירים בגואנין. מבנה G4 מבוסס על היווצרות טטרמרים מישוריים, הנקראים G-tetrads, שבהם ארבעה גואנינים מתקשרים באמצעות קשרי מימן Hoogsteen. G-tetrads מוערמים ומיוצבים עוד יותר על-ידי קטיונים חד-ערכיים המתואמים במרכז ליבת הגואנין (איור 1)1.
איור 1: ייצוג סכמטי של מבנה G-quadruplex. (A) ייצוג סכמטי של G-tetrad. המערך המישורי מיוצב על ידי זיווג בסיס Hoogsteen ועל ידי קטיון מרכזי (M+). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
רצפים עם ארבע ריצות או יותר של לפחות שני נוקלאוטידים עוקבים של גואנין הם רצפים פוטנציאליים יוצרי G-quadruplex (PQSs) שיכולים להתקפל במבני G-quadruplex. PQS ממוקמים בהקשרים תאיים רבים ושונים, כגון בטלומרים, מקדמי גנים, דנ”א ריבוזומלי ואתרי רקומבינציה, והם מעורבים בוויסות תהליכים ביולוגיים רבים2. לפיכך, הזיהוי והאימות הניסיוני של G4s בגנום האנושי, המבוצע כיום בעיקר באמצעות כלים חישוביים, הוא נושא רלוונטי מבחינה ביולוגית3. על מנת לתמוך בתחזיות חישוביות או לזהות מבני G4 בלתי צפויים, מוצגת כאן שיטה נגישה המבוססת על מיפוי כימי לזיהוי היווצרות G4 בתבנית DNA, המאפשרת זיהוי מדויק של גואנינים המרכיבים את מבנה G-tetrad.
בדיקת המיפוי הכימי המדווחת מנצלת את התגובתיות השונה של bis-3-chloropiperidines (B-CePs) עם גואנינים לאחר היווצרות מבני G4. בשל תגובתם הגבוהה לנוקלאופילים 4,5,6,7,8,9, B-CePs הם חומרים אלקילטים של חומצות גרעין עם היכולת להגיב ביעילות רבה עם מיקום N 7 של נוקלאוטידים גואנין10. אלקילציה מלווה בדפורינציה ובפיצול גדילים במבני DNA חד-גדיליים ודו-גדילים. נהפוך הוא, הגואנינים המעורבים בהיווצרות הטטרדות G בסידורי G4 אטומים לאלקילציה B-CeP, שכן מיקום N7 של גואנינים מעורב בקשרי המימן של Hoogsteen. תגובתיות ספציפית זו של B-CePs מאפשרת לא רק זיהוי של מבני G4, אלא גם זיהוי של הגואנינים המרכיבים את הטטרדים, כפי שניתן להסיק מהם מההגנה היחסית שלהם מפני אלקילציה בהשוואה לגואנינים בדנ”א חד-גדילי ודו-גדילי.
פרוטוקול המיפוי הכימי מדווח כאן באמצעות B-CeP 1 (איור 2A) כבדיקה לאפיון של אפטמר קושר טרומבין (TBA), דנ”א של 15 מר המסוגל להניח את סידור G4 בנוכחות קטיונים של אשלגן11,12. סידור G4 של TBA (G4-TBA) מושווה ישירות לשני פקדים, כלומר TBA בצורה חד-גדילית (ssTBA) ו-TBA מחושל לרצף המשלים שלו כדי ליצור את המבנה הדו-גדילי (dsTBA) (טבלה 1). תוצרים של תגובות חיטוט נפתרים על ידי אלקטרופורזה של ג’ל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה (PAGE) ברמת הנוקלאוטיד היחיד על ידי איתור צינורות אלקילציה בודדים ומחשוף גדילי DNA בגואנינים האלקילטים. הדמיה על הג’ל מתאפשרת על ידי הצמדה של אוליגונוקלאוטיד TBA עם פלואורופור בקצה 3 אינץ’ שלו (טבלה 1). פרוטוקול זה מראה כיצד לקפל TBA בקונפורמציות השונות שלו (G4 ובקרות), וכיצד לבצע תגובות חיטוט עם B-CePs ואחריו PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
G-quadruplexes הם מבנים משניים של חומצות גרעין המתקפלים בדרך כלל בתוך רצפי DNA עשירים בגואנין, והם מטרות מחקר משמעותיות בגלל הקשר שלהם עם בקרה גנטית ומחלות. מיפוי כימי על ידי B-CePs הוא פרוטוקול שימושי לאפיון DNA G4s, אשר יכול לשמש לזיהוי בסיסי גואנין המעורבים בהיווצרות G-tetrads בתנאי מלח פיזיולוגיים.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה למדעי התרופות והפרמקולוגיות, אוניברסיטת פדובה (PRIDJ-BIRD2019).
Materials
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5′-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
- Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
- Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
- Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
- Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
- Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
- Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
- Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
- Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
- Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
- Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
- Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
- Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).
