In vitro Mapeamento químico de estruturas do DNA G-Quadruplex por bis-3-cloropiperidinas;

Além da típica dupla hélice de Watson-Crick, os ácidos nucléicos podem adotar várias estruturas secundárias, como a forma alternativa G-quadruplex (G4), devido às suas sequências ricas em guanina. A estrutura G4 é baseada na formação de tetrâmeros planares, chamados de G-tétrades, nos quais quatro guaninas interagem através de ligações de hidrogênio Hoogsteen. As tétrades G são empilhadas e posteriormente estabilizadas por cátions monovalentes que são coordenados no centro do núcleo da guanina (Figura 1)¹.

Figura 1: Representação esquemática de uma estrutura G-quadruplex (A) Representação esquemática de um G-tétrade. A matriz planar é estabilizada pelo pareamento de bases de Hoogsteen e por um cátion central (M⁺). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sequências com quatro ou mais tiragens de pelo menos dois nucleotídeos guaninos consecutivos são potenciais sequências formadoras de G-quadruplex (PQSs) que podem dobrar em estruturas G-quadruplex . Os PQS estão localizados em diversos contextos celulares, como telômeros, promotores gênicos, DNA ribossomal e sítios de recombinação, e estão envolvidos na regulação de muitos processos biológicos². Assim, a identificação e validação experimental de G4s no genoma humano, que atualmente é realizada principalmente por meio de ferramentas computacionais, é uma questão biologicamente relevante³. A fim de apoiar predições computacionais ou detectar estruturas G4 imprevisíveis, um método acessível baseado em mapeamento químico para identificar a formação de G4 em um molde de DNA é mostrado aqui, permitindo a identificação precisa de guaninas que formam a estrutura G-tétrade.

O ensaio de mapeamento químico relatado explora a reatividade diferente de bis-3-cloropiperidinas (B-CePs) com guaninas após a formação de estruturas G4. Devido à sua alta reatividade com nucleófilos 4,5,6,7,8,9^, as B-CePs são agentes alquilantes de ácidos nucleicos com capacidade de reagir de forma muito eficiente com a posição N 7 dos nucleotídeos guanina¹⁰. A alquilação é seguida por depuração e clivagem de fitas em construções de DNA de fita simples e dupla. Pelo contrário, guaninas envolvidas na formação das G-tétrades em arranjos G4 são impermeáveis à alquilação B-CeP, já que a posição N7 das guaninas está implicada nas ligações de hidrogênio Hoogsteen. Essa reatividade específica dos B-CePs permite não apenas a detecção de estruturas G4, mas também a identificação das guaninas que formam a(s) tétrade(s), pois elas podem ser deduzidas de sua relativa proteção contra alquilação em comparação com guaninas em DNA de fita simples e dupla.

O protocolo de mapeamento químico é relatado aqui usando B-CeP 1 (Figura 2A) como sonda para a caracterização do aptâmero ligante de trombina (TBA), um DNA de 15 meros capaz de assumir o arranjo G4 na presença de cátions potássio^11,12. O arranjo G4 do TBA (G4-TBA) é diretamente comparado com dois controles, a saber, TBA na forma de fita simples (ssTBA) e TBA recozido em sua sequência complementar para formar o construto de fita dupla (dsTBA) (Tabela 1). Os produtos das reações de sondagem são resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução (PAGE) no nível de nucleotídeo único, localizando adutos de alquilação individuais e clivagem de fita de DNA nas guaninas alquiladas. A visualização do gel é possibilitada pela conjugação do oligonucleotídeo TBA com um fluoróforo em sua extremidade 3′ (Tabela 1). Este protocolo mostra como dobrar TBA em suas diferentes conformações (G4 e controles), e como realizar reações de sondagem com B-CePs seguido de PAGE.