Tomografía fotoacústica, ecográfica y angiográfica integrada (PAUSAT) para imágenes cerebrales completas no invasivas del accidente cerebrovascular isquémico
Summary
Este trabajo demuestra el uso de una plataforma de imágenes multimodal basada en ultrasonido para imágenes no invasivas de accidentes cerebrovasculares isquémicos. Este sistema permite la cuantificación de la oxigenación de la sangre a través de imágenes fotoacústicas y la perfusión deteriorada en el cerebro a través de la angiografía acústica.
Abstract
Aquí se presenta un estudio experimental de accidente cerebrovascular isquémico utilizando nuestro sistema de imágenes no invasivo recientemente desarrollado que integra tres tecnologías de imágenes acústicas: fotoacústica, ultrasonido y tomografía angiográfica (PAUSAT). La combinación de estas tres modalidades ayuda a adquirir la tomografía fotoacústica multiespectral (PAT) de la oxigenación de la sangre cerebral, las imágenes de ultrasonido de alta frecuencia del tejido cerebral y la angiografía acústica de la perfusión sanguínea cerebral. La plataforma de imágenes multimodales permite el estudio de los cambios de perfusión cerebral y oxigenación en todo el cerebro del ratón después de un accidente cerebrovascular. Se evaluaron dos modelos de accidente cerebrovascular isquémico comúnmente utilizados: el modelo de oclusión permanente de la arteria cerebral media (pMCAO) y el modelo fototrombótico (TP). PAUSAT se utilizó para obtener imágenes de los mismos cerebros de ratón antes y después de un accidente cerebrovascular y analizar cuantitativamente ambos modelos de accidente cerebrovascular. Este sistema de imágenes fue capaz de mostrar claramente los cambios vasculares cerebrales después del accidente cerebrovascular isquémico, incluida la reducción significativa de la perfusión sanguínea y la oxigenación en la región del infarto del accidente cerebrovascular (ipsilateral) en comparación con el tejido no lesionado (contralateral). Los resultados fueron confirmados por imágenes de contraste moteado láser y tinción de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC). Además, el volumen del infarto de accidente cerebrovascular en ambos modelos de accidente cerebrovascular se midió y validó mediante tinción TTC como la verdad fundamental. A través de este estudio, hemos demostrado que PAUSAT puede ser una herramienta poderosa en estudios preclínicos no invasivos y longitudinales de accidente cerebrovascular isquémico.
Introduction
La sangre transporta oxígeno (a través de la proteína hemoglobina) y otros nutrientes importantes a los tejidos de nuestro cuerpo. Cuando se interrumpe el flujo de sangre a través de los tejidos (isquemia), puede producirse un daño grave a los tejidos, cuyos efectos más inmediatos se deben a la falta de oxígeno (hipoxia). El accidente cerebrovascular isquémico es el resultado de un flujo sanguíneo interrumpido a cierta región del cerebro. El daño cerebral resultante de un accidente cerebrovascular isquémico puede ocurrir a los pocos minutos de la obstrucción de un vaso, y a menudo puede tener efectos debilitantes y duraderos 1,2. Una estrategia muy valiosa para evaluar la fisiopatología después del accidente cerebrovascular isquémico e identificar y probar nuevos tratamientos es el uso de modelos de animales pequeños en el laboratorio. Los tratamientos descubiertos en el laboratorio tienen como objetivo traducirse al uso clínico y mejorar la vida de los pacientes. Sin embargo, el uso de animales en la investigación biomédica debe evaluarse cuidadosamente de acuerdo con los principios de las 3R de Russell y Burch: reemplazo, reducción y refinamiento3. El objetivo del componente de reducción es reducir el número de animales sin comprometer la recopilación de datos. Con esto en mente, poder evaluar longitudinalmente la evolución de la lesión a través de imágenes no invasivas permite una gran ventaja en la reducción del número de animales requeridos, así como maximizar la información obtenida de cada animal4.
La tomografía fotoacústica (PAT) es una modalidad de imagen híbrida que combina el contraste de absorción óptica con la resolución espacial de imágenes de ultrasonido5. El mecanismo de imagen de PAT es el siguiente. Un pulso láser de excitación se ilumina en el objetivo que se está fotografiando. Suponiendo que el objetivo absorbe la luz en la longitud de onda del láser de excitación, aumentará su temperatura. Este rápido aumento de la temperatura da como resultado una expansión termoelástica del objetivo. La expansión hace que una onda de ultrasonido se propague desde el objetivo. Al detectar la onda de ultrasonido en muchas posiciones, el tiempo requerido para que la onda se propague desde el objetivo a los detectores se puede utilizar para crear una imagen a través de un algoritmo de reconstrucción. La capacidad de PAT para detectar la absorción óptica en regiones de tejido profundo diferencia PAT de la imagen de ultrasonido, que detecta límites de diferentes impedancias acústicas de los tejidos5. En los espectros visible e infrarrojo cercano, las principales biomoléculas altamente absorbentes que son abundantes en los organismos son la hemoglobina, los lípidos, la melanina y el agua7. De particular interés en el estudio del accidente cerebrovascular es la hemoglobina. Dado que la oxihemoglobina y la desoxihemoglobina tienen diferentes espectros de absorción óptica, PAT se puede usar con múltiples longitudes de onda láser de excitación para determinar la concentración relativa de los dos estados de la proteína. Esto permite cuantificar la saturación de oxígeno de la hemoglobina (sO2), u oxigenación sanguínea, dentro y fuera de la región del infarto 8,9. Esta es una medida importante en el accidente cerebrovascular isquémico, ya que puede indicar el nivel de oxígeno en el tejido cerebral dañado después de la isquemia.
La angiografía acústica (AA) es un método de imagen de ultrasonido con contraste que es particularmente útil para obtener imágenes de la morfología de la vasculatura in vivo10. El método se basa en el uso de un transductor wobbler de doble elemento (un elemento de baja frecuencia y un elemento de alta frecuencia) junto con microburbujas inyectadas en el sistema circulatorio del sujeto de imágenes. El elemento de baja frecuencia del transductor se utiliza para transmitir a la frecuencia resonante de las microburbujas (por ejemplo, 2 MHz), mientras que el elemento de alta frecuencia se utiliza para recibir las señales superarmónicas de las microburbujas (por ejemplo, 26 MHz). Cuando se excitan a una frecuencia resonante, las microburbujas tienen una fuerte respuesta no lineal, lo que resulta en la producción de señales súper armónicas que los tejidos corporales circundantes no producen11. Al recibir con un elemento de alta frecuencia, esto asegura que solo se detecten las señales de microburbujas. Dado que las microburbujas están confinadas a los vasos sanguíneos, el resultado es una imagen angiográfica de la morfología de los vasos sanguíneos. AA es un método poderoso para obtener imágenes del accidente cerebrovascular isquémico, ya que las microburbujas que fluyen a través del sistema circulatorio no pueden fluir a través de los vasos bloqueados. Esto permite que AA detecte regiones del cerebro que no están perfundidas debido a un accidente cerebrovascular isquémico, lo que indica la región del infarto.
La investigación preclínica del accidente cerebrovascular isquémico generalmente se basa en el uso de histología y pruebas conductuales para evaluar la ubicación y la gravedad del accidente cerebrovascular. La tinción con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) es un análisis histológico común utilizado para determinar el volumen del infarto sistólico. Sin embargo, solo puede ser utilizado en un punto final, ya que requiere que el animal sea sacrificado12. Las pruebas de comportamiento pueden ser utilizadas para determinar el deterioro de la función motora en múltiples puntos de tiempo, pero no pueden proporcionar valores anatómicos o fisiológicos cuantitativos13. La imagen biomédica proporciona un enfoque más cuantitativo para estudiar los efectos del accidente cerebrovascular isquémico de forma no invasiva y longitudinal 9,14,15. Sin embargo, las tecnologías de imagen existentes (como la resonancia magnética [MRI] de animales pequeños) pueden tener un alto costo, no pueden proporcionar información estructural y funcional concurrente o tienen una profundidad de penetración limitada (como la mayoría de las técnicas de imágenes ópticas).
Aquí, combinamos tomografía fotoacústica, ecográfica y angiográfica (PAUSAT; ver diagrama del sistema en la Figura 1), que permite información estructural y funcional complementaria de la perfusión sanguínea y la oxigenación después del accidente cerebrovascular isquémico16. Estos son dos aspectos importantes para evaluar la gravedad de la lesión y monitorear la recuperación o la respuesta a los tratamientos. El uso de estos métodos de imagen integrados puede aumentar la cantidad de información obtenida por cada animal, reduciendo el número de animales requeridos y proporcionando más información en el estudio de posibles tratamientos para el accidente cerebrovascular isquémico.
Figura 1: Diagrama PAUSAT. (A) Esquema completo del sistema PAUSAT, incluyendo el láser y el OPO utilizados para PAT. (B) Vista interior del sistema PAUSAT, incluidos dos transductores de ultrasonido. El transductor wobbler de doble elemento se utiliza tanto para ultrasonido en modo B como para AA, y el transductor de matriz lineal se utiliza para PAT. Ambos transductores están montados en la misma etapa motorizada 2D, lo que permite que el escaneo genere datos volumétricos. Esta cifra se ha modificado de16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay algunos aspectos vitales de este método que, si se hacen incorrectamente, pueden conducir a una disminución significativa de la calidad de imagen y el análisis cuantitativo. El resultado más común del error del usuario en las imágenes PAUSAT es la falta de señal o la intensidad de señal muy baja, los cuales pueden ocurrir por una variedad de razones. Una de esas razones es un problema con el acoplamiento acústico. Las grandes burbujas de aire en el agua que rodea la cabeza del ratón durante la obtención de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al equipo de ingeniería de SonoVol Inc. por su soporte técnico. Este trabajo fue parcialmente patrocinado por el Premio de Ciencias Colaborativas de la Asociación Americana del Corazón (18CSA34080277), a J. Yao y W. Yang; Los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (NIH) otorgan R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (Iniciativa BRAIN), R01 NS111039, R01 EB028143; El premio CAREER de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (NSF) 2144788; la Beca de la Iniciativa Chan Zuckerberg (2020-226178), a J. Yao; y los NIH otorgan R21NS127163 y R01NS099590 a W. Yang.
Materials
| 20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
| 532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
| Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
| Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
| C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
| Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
| Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
| Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
| Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
| Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
| Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
| High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
| IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
| Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
| Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
| Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
| Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
| Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
| Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
| Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
| Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
| Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
| VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |
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