İskemik İnmenin Nonİnvaziv Tüm Beyin Görüntülemesi için Entegre Fotoakustik, Ultrason ve Anjiyografik Tomografi (PAUSAT)
Summary
Bu çalışma, iskemik inmenin noninvaziv görüntülenmesi için multimodal ultrason tabanlı bir görüntüleme platformunun kullanımını göstermektedir. Bu sistem, fotoakustik görüntüleme yoluyla kan oksijenasyonunun ölçülmesine ve akustik anjiyografi ile beyindeki bozulmuş perfüzyonun ölçülmesine izin verir.
Abstract
Burada, üç akustik tabanlı görüntüleme teknolojisini birleştiren yeni geliştirilen noninvaziv görüntüleme sistemimizi kullanan deneysel bir iskemik inme çalışması sunulmaktadır: fotoakustik, ultrason ve anjiyografik tomografi (PAUSAT). Bu üç modalitenin birleştirilmesi, beyin kan oksijenasyonunun multispektral fotoakustik tomografisinin (PAT), beyin dokusunun yüksek frekanslı ultrason görüntülemesinin ve serebral kan perfüzyonunun akustik anjiyografisinin elde edilmesine yardımcı olur. Multi-modal görüntüleme platformu, inme sonrası tüm fare beynindeki serebral perfüzyon ve oksijenasyon değişikliklerinin incelenmesine izin verir. Yaygın olarak kullanılan iki iskemik inme modeli değerlendirildi: kalıcı orta serebral arter tıkanıklığı (pMCAO) modeli ve fototrombotik (PT) model. PAUSAT, bir inmeden önce ve sonra aynı fare beyinlerini görüntülemek ve her iki vuruş modelini de nicel olarak analiz etmek için kullanıldı. Bu görüntüleme sistemi, iskemik inme sonrası beyin vasküler değişikliklerini, inme enfarktüs bölgesinde (ipsilateral) yaralanmamış dokuya (kontralateral) kıyasla önemli ölçüde azalmış kan perfüzyonu ve oksijenasyon da dahil olmak üzere açıkça gösterebildi. Sonuçlar hem lazer benek kontrast görüntüleme hem de trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyaması ile doğrulandı. Ayrıca, her iki inme modelinde de inme enfarktüsü hacmi, TTC boyama ile temel gerçek olarak ölçülmüş ve doğrulanmıştır. Bu çalışma sayesinde, PAUSAT’ın iskemik inmenin noninvaziv ve uzunlamasına preklinik çalışmalarında güçlü bir araç olabileceğini gösterdik.
Introduction
Kan, oksijeni (hemoglobin proteini yoluyla) ve diğer önemli besinleri vücudumuzdaki dokulara taşır. Dokulardan kan akışı kesildiğinde (iskemi), dokularda ciddi hasarlar meydana gelebilir, bunların en acil etkileri oksijen eksikliğinden (hipoksi) kaynaklanır. İskemik inme, beynin belirli bir bölgesine kesilen kan akışının bir sonucudur. İskemik inmeden kaynaklanan beyin hasarı, damar tıkanmasından birkaç dakika sonra ortaya çıkabilir ve genellikle zayıflatıcı ve kalıcı etkilere sahip olabilir 1,2. İskemik inme sonrası fizyopatolojiyi değerlendirmek ve yeni tedavileri tanımlamak ve test etmek için son derece değerli bir strateji, laboratuarda küçük hayvan modellerinin kullanılmasıdır. Laboratuvarda keşfedilen tedaviler, klinik kullanıma çevrilmeyi ve hastaların yaşamlarını iyileştirmeyi amaçlamaktadır. Bununla birlikte, biyomedikal araştırmalarda hayvanların kullanımı, Russell ve Burch’un 3R ilkelerine göre dikkatlice değerlendirilmelidir: değiştirme, azaltma ve iyileştirme3. İndirgeme bileşeninin amacı, veri toplamadan ödün vermeden hayvan sayısını azaltmaktır. Bunu akılda tutarak, lezyon evrimini noninvaziv görüntüleme yoluyla uzunlamasına değerlendirebilmek, gerekli hayvan sayısını azaltmanın yanı sıra her bir hayvandan elde edilen bilgileri en üst düzeye çıkarmada büyük bir avantaj sağlar4.
Fotoakustik tomografi (PAT), optik absorpsiyon kontrastını ultrason görüntüleme uzamsal çözünürlük5 ile birleştiren hibrid bir görüntüleme yöntemidir. PAT’ın görüntüleme mekanizması aşağıdaki gibidir. Görüntülenen hedef üzerinde bir uyarma lazer darbesi aydınlatılır. Hedefin uyarma lazerinin dalga boyundaki ışığı emdiğini varsayarsak, sıcaklık artacaktır. Sıcaklıktaki bu hızlı artış, hedefin termoelastik bir genişlemesine neden olur. Genişleme, bir ultrason dalgasının hedeften dışarı yayılmasına neden olur. Ultrason dalgasını birçok pozisyonda tespit ederek, dalganın hedeften dedektörlere yayılması için gereken süre, bir rekonstrüksiyon algoritması aracılığıyla bir görüntü oluşturmak için kullanılabilir. PAT’ın derin doku bölgelerinde optik absorpsiyonu tespit etme yeteneği, PAT’ı dokuların farklı akustik empedanslarının sınırlarını tespit eden ultrason görüntülemeden ayırır5. Görünür ve yakın kızılötesi spektrumlarda, organizmalarda bol miktarda bulunan birincil yüksek emici biyomoleküller hemoglobin, lipitler, melanin ve su7’dir. İnme çalışmasında özellikle ilgi çekici olan hemoglobindir. Oksihemoglobin ve deoksihemoglobin farklı optik absorpsiyon spektrumlarına sahip olduklarından, PAT, proteinin iki durumunun nispi konsantrasyonunu belirlemek için çoklu uyarma lazer dalga boyları ile kullanılabilir. Bu, hemoglobinin oksijen doygunluğunun (sO2) veya kan oksijenasyonunun, enfarktüs bölgesi 8,9’un içinde ve dışında ölçülmesini sağlar. Bu, iskemik inmede önemli bir önlemdir, çünkü iskemi sonrası hasarlı beyin dokusundaki oksijen seviyesini gösterebilir.
Akustik anjiyografi (AA), vaskülatürün morfolojisini in vivo10 olarak görüntülemek için özellikle yararlı olan kontrastlı bir ultrason görüntüleme yöntemidir. Yöntem, görüntüleme konusunun dolaşım sistemine enjekte edilen mikro kabarcıklarla birlikte çift elemanlı bir sallanan dönüştürücünün (düşük frekanslı bir eleman ve yüksek frekanslı bir eleman) kullanılmasına dayanır. Transdüserin düşük frekanslı elemanı, mikrokabarcıkların rezonans frekansında (örneğin, 2 MHz) iletmek için kullanılırken, yüksek frekanslı eleman mikro kabarcıkların süper harmonik sinyallerini almak için kullanılır (örneğin, 26 MHz). Bir rezonans frekansında uyarıldığında, mikrokabarcıklar güçlü bir doğrusal olmayan tepkiye sahiptir, bu da çevredeki vücut dokularının11 üretmediği süper harmonik sinyallerin üretilmesine neden olur. Yüksek frekanslı bir elemanla alarak, bu sadece mikro kabarcık sinyallerinin algılanmasını sağlar. Mikrokabarcıklar kan damarlarıyla sınırlı olduğundan, sonuç kan damarı morfolojisinin anjiyografik bir görüntüsüdür. AA, iskemik inmeyi görüntülemek için güçlü bir yöntemdir, çünkü dolaşım sisteminden akan mikro kabarcıklar tıkanmış damarlardan akamaz. Bu, AA’nın beynin enfarktüs bölgesini gösteren iskemik inme nedeniyle perfüze edilmeyen bölgelerini tespit etmesini sağlar.
Preklinik iskemik inme araştırmaları genellikle inmenin yerini ve şiddetini değerlendirmek için histoloji ve davranış testlerinin kullanımına dayanır. Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyaması, inme enfarktüs hacmini belirlemek için kullanılan yaygın bir histolojik analizdir. Bununla birlikte, hayvanın ötenazi yapılmasını gerektirdiğinden yalnızca bir uç noktada kullanılabilir12. Davranış testleri, birden fazla zaman noktasında motor fonksiyon bozukluğunu belirlemek için kullanılabilir, ancak nicel anatomik veya fizyolojik değerler sağlayamazlar13. Biyomedikal görüntüleme, iskemik inmenin etkilerini noninvaziv ve boyuna incelemek için daha nicel bir yaklaşım sağlar 9,14,15. Bununla birlikte, mevcut görüntüleme teknolojileri (küçük hayvanlı manyetik rezonans görüntüleme [MRG] gibi) yüksek bir maliyetle gelebilir, eşzamanlı yapısal ve fonksiyonel bilgi sağlayamaz veya sınırlı penetrasyon derinliğine sahip olabilir (çoğu optik görüntüleme tekniği gibi).
Burada, fotoakustik, ultrason ve anjiyografik tomografiyi (PAUSAT; Şekil 1’deki sistem diyagramına bakınız) birleştiriyoruz, bu da iskemik inme16 sonrası kan perfüzyonu ve oksijenasyonun tamamlayıcı yapısal ve fonksiyonel bilgilerini sağlıyor. Bunlar, yaralanmanın ciddiyetini değerlendirmede ve iyileşmeyi veya tedavilere yanıtı izlemede iki önemli husustur. Bu entegre görüntüleme yöntemlerinin kullanılması, her hayvan tarafından elde edilen bilgi miktarını artırabilir, gerekli hayvan sayısını azaltabilir ve iskemik inme için potansiyel tedavilerin incelenmesinde daha fazla bilgi sağlayabilir.
Şekil 1: PAUSAT diyagramı. (A) PAT için kullanılan lazer ve OPO dahil olmak üzere PAUSAT sisteminin tam şeması. (B) İki ultrason transdüseri de dahil olmak üzere PAUSAT sisteminin iç görünümü. Çift elemanlı yalpalayan transdüser hem B modu ultrason hem de AA için kullanılır ve doğrusal dizi dönüştürücü PAT için kullanılır. Her iki transdüser de aynı 2D motorlu aşamaya monte edilmiştir ve taramanın hacimsel veriler üretmesine izin verir. Bu rakam16’dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemin, yanlış yapıldığında, görüntü kalitesinin ve nicel analizin önemli ölçüde azalmasına neden olabilecek birkaç hayati yönü vardır. PAUSAT görüntülerinde kullanıcı hatasının en sık ortaya çıkan sonucu, her ikisi de çeşitli nedenlerle ortaya çıkabilen sinyal eksikliği veya çok düşük sinyal gücüdür. Böyle bir neden, akustik kaplin ile ilgili bir sorundur. Görüntüleme sırasında farenin kafasını çevreleyen sudaki büyük hava kabarcıkları genellikle ultrasonun dön…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, teknik destekleri için SonoVol Inc.’deki mühendislik ekibine teşekkür etmek ister. Bu çalışma kısmen Amerikan Kalp Derneği İşbirlikçi Bilimler Ödülü (18CSA34080277), J. Yao ve W. Yang; Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (BRAIN Initiative), R01 NS111039, R01 EB028143; Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilim Vakfı (NSF) KARİYER ödülü 2144788; Chan Zuckerberg Girişimi Hibesi (2020-226178), J. Yao’ya; ve NIH, W. Yang’a R21NS127163 ve R01NS099590 verir.
Materials
| 20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
| 532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
| Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
| Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
| C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
| Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
| Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
| Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
| Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
| Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
| Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
| High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
| IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
| Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
| Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
| Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
| Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
| Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
| Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
| Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
| Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
| Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
| VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |
References
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 87 (1), 179-197 (2007).
- Vander Worp, H. B., van Gijn, J. Clinical Practice. Acute ischemic stroke. The New England Journal of Medicine. 357 (6), 572-579 (2007).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch’s 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Hochrainer, K., Yang, W. Stroke proteomics: from discovery to diagnostic and therapeutic applications. Circulation Research. 130 (8), 1145-1166 (2022).
- Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nature Methods. 13 (8), 627-638 (2016).
- Aldrich, J. E. Basic physics of ultrasound imaging. Critical Care Medicine. 35 (5), S131-S137 (2007).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37-R61 (2013).
- Li, M., Tang, Y., Yao, J. Photoacoustic tomography of blood oxygenation: a mini review. Photoacoustics. 10, 65-73 (2018).
- Menozzi, L., Yang, W., Feng, W., Yao, J. Sound out the impaired perfusion: Photoacoustic imaging in preclinical ischemic stroke. Frontiers in Neuroscience. 16, 1055552 (2022).
- Gessner, R. C., Frederick, C. B., Foster, F. S., Dayton, P. A. Acoustic angiography: a new imaging modality for assessing microvasculature architecture. International Journal of Biomedical Imaging. 2013, 936593 (2013).
- Dayton, P. A., Rychak, J. J. Molecular ultrasound imaging using microbubble contrast agents. Frontiers in Bioscience. 12, 5124-5142 (2007).
- Isayama, K., Pitts, L. H., Nishimura, M. C. Evaluation of 2, 3, 5-triphenyitetrazolium chloride staining to delineate rat brain infarcts. Stroke. 22 (11), 1394-1398 (1991).
- Ruan, J., Yao, Y. Behavioral tests in rodent models of stroke. Brain Hemorrhages. 1 (4), 171-184 (2020).
- Parthasarathy, A. B., Kazmi, S. M. S., Dunn, A. K. Quantitative imaging of ischemic stroke through thinned skull in mice with Multi Exposure Speckle Imaging. Biomedical Optics Express. 1 (1), 246-259 (2010).
- Hingot, V., et al. Early ultrafast ultrasound imaging of cerebral perfusion correlates with ischemic stroke outcomes and responses to treatment in mice. Theranostics. 10 (17), 7480-7491 (2020).
- Menozzi, L., et al. Three-dimensional non-invasive brain imaging of ischemic stroke by integrated photoacoustic, ultrasound and angiographic tomography (PAUSAT). Photoacoustics. 29, 100444 (2022).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments. (89), e51729 (2014).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
- Labat-Gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments. (76), e50370 (2013).
- Matsumoto, Y., et al. Visualising peripheral arterioles and venules through high-resolution and large-area photoacoustic imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14930 (2018).
- Xu, Y., Wang, L. V., Ambartsoumian, G., Kuchment, P. Reconstructions in limited-view thermoacoustic tomography. Medical Physics. 31 (4), 724-733 (2004).
- Yal Tang, ., et al. High-fidelity deep functional photoacoustic tomography enhanced by virtual point sources. Photoacoustics. 29, 100450 (2023).
- Zheng, W., Huang, C., Zhang, H., Xia, J. Slit-based photoacoustic tomography with co-planar light illumination and acoustic detection for high-resolution vascular imaging in human using a linear transducer array. Biomedical Engineering Letters. 12 (2), 125-133 (2022).
- Wang, Y., et al. Slit-enabled linear-array photoacoustic tomography with near isotropic spatial resolution in three dimensions. Optics Letters. 41 (1), 127-130 (2016).
- Vu, T., Li, M., Humayun, H., Zhou, Y., Yao, J. A generative adversarial network for artifact removal in photoacoustic computed tomography with a linear-array transducer. Experimental Biology and Medicine. 245 (7), 597-605 (2020).
- Zhang, H., et al. Deep-E: A fully-dense neural network for improving the elevation resolution in linear-array-based photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (5), 1279-1288 (2022).
- Hauptmann, A., et al. Model-based learning for accelerated, limited-view 3-D photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (6), 1382-1393 (2018).
- Li, M., et al. Three-dimensional deep-tissue functional and molecular imaging by integrated photoacoustic, ultrasound, and angiographic tomography (PAUSAT). IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (10), 2704-2714 (2022).
