허혈성 뇌졸중의 비침습적 전뇌 영상을 위한 통합 광음향, 초음파 및 혈관조영 단층촬영(PAUSAT)
Summary
이 작업은 허혈성 뇌졸중의 비침습적 이미징을 위한 다중 모드 초음파 기반 이미징 플랫폼의 사용을 보여줍니다. 이 시스템은 광음향 영상을 통한 혈액 산소화의 정량화와 음향 혈관 조영술을 통한 뇌의 관류 장애를 허용합니다.
Abstract
여기에 제시된 것은 광음향, 초음파 및 혈관 조영 단층 촬영(PAUSAT)의 세 가지 음향 기반 영상 기술을 통합하는 새로 개발된 비침습적 영상 시스템을 사용한 실험적 허혈성 뇌졸중 연구입니다. 이 세 가지 양식을 결합하면 뇌의 다중 스펙트럼 광음향 단층 촬영(PAT), 혈액 산소화, 뇌 조직의 고주파 초음파 영상 및 대뇌 혈액 관류의 음향 혈관 조영술을 획득하는 데 도움이 됩니다. 다중 모드 이미징 플랫폼을 사용하면 뇌졸중 후 전체 마우스 뇌의 대뇌 관류 및 산소 공급 변화를 연구할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 허혈성 뇌졸중 모델인 영구 중대뇌동맥 폐색(pMCAO) 모델과 광혈전(PT) 모델을 평가했습니다. PAUSAT는 뇌졸중 전후의 동일한 마우스 뇌를 이미지화하고 두 뇌졸중 모델을 정량적으로 분석하는 데 사용되었습니다. 이 이미징 시스템은 손상되지 않은 조직(반대측)에 비해 뇌졸중 경색 영역(동측)에서 현저히 감소된 혈액 관류 및 산소 공급을 포함하여 허혈성 뇌졸중 후 뇌 혈관 변화를 명확하게 보여줄 수 있었습니다. 결과는 레이저 스페클 조영 이미징과 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색으로 확인되었습니다. 또한, 두 뇌졸중 모델 모두에서 뇌졸중 경색 부피를 측정하고 TTC 염색에 의해 실측 자료로 검증했습니다. 이 연구를 통해 우리는 PAUSAT가 허혈성 뇌졸중의 비침습적 및 종단적 전임상 연구에서 강력한 도구가 될 수 있음을 입증했습니다.
Introduction
혈액은 산소(헤모글로빈 단백질을 통해)와 기타 중요한 영양소를 우리 몸의 조직으로 운반합니다. 조직을 통한 혈액의 흐름이 중단되면 (허혈), 조직에 심각한 손상이 발생할 수 있으며, 그 중 가장 즉각적인 영향은 산소 부족 (저산소증)으로 인한 것입니다. 허혈성 뇌졸중은 뇌의 특정 영역으로의 혈류가 중단 된 결과입니다. 허혈성 뇌졸중으로 인한 뇌 손상은 혈관이 막힌 후 몇 분 이내에 발생할 수 있으며 종종 쇠약하고 지속적인 영향을 미칠 수 있습니다 1,2. 허혈성 뇌졸중 후 생리병리를 평가하고 새로운 치료법을 확인 및 테스트하기 위한 매우 가치 있는 전략은 실험실에서 소동물 모델을 사용하는 것입니다. 실험실에서 발견된 치료법은 임상용으로 전환되어 환자의 삶을 개선하는 것을 목표로 합니다. 그러나 생물의학 연구에서 동물의 사용은 Russell과 Burch의 3R 원칙(대체, 감소 및 정제)에 따라 신중하게 평가되어야 합니다.3. 감소 구성 요소의 목적은 데이터 수집을 손상시키지 않으면서 동물 수를 줄이는 것입니다. 이를 염두에 두고, 비침습적 영상을 통해 병변의 진화를 종단적으로 평가할 수 있다는 것은 필요한 동물의 수를 줄이는 데 큰 이점을 제공할 뿐만 아니라 각 동물로부터 얻은 정보를 최대화할 수 있다4.
광음향 단층 촬영(PAT)은 광학 흡수 대비와 초음파 영상공간 해상도를 결합한 하이브리드 영상 방식이다5. PAT의 이미징 메커니즘은 다음과 같습니다. 여기 레이저 펄스가 이미징되는 대상에 조명됩니다. 타겟이 여기 레이저의 파장에서 빛을 흡수한다고 가정하면 온도가 증가합니다. 이러한 급격한 온도 상승은 대상의 열탄성 팽창을 초래합니다. 팽창으로 인해 초음파가 대상에서 전파됩니다. 여러 위치에서 초음파를 감지함으로써 파동이 대상에서 검출기로 전파되는 데 필요한 시간을 재구성 알고리즘을 통해 이미지를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 심부 조직 영역에서 광학 흡수를 감지하는 PAT의 능력은 조직의 서로 다른 음향 임피던스의 경계를 감지하는 초음파 영상과 PAT를 구별합니다5. 가시광선 및 근적외선 스펙트럼에서 유기체에 풍부한 주요 흡수율 생체 분자는 헤모글로빈, 지질, 멜라닌 및 물입니다7. 뇌졸중 연구에서 특히 흥미로운 것은 헤모글로빈입니다. 옥시헤모글로빈과 데옥시헤모글로빈은 광학 흡수 스펙트럼이 다르기 때문에 PAT는 다중 여기 레이저 파장과 함께 사용하여 단백질의 두 상태의 상대적 농도를 결정할 수 있습니다. 이를 통해 헤모글로빈(sO2)의 산소 포화도 또는 혈액 산소화가 경색 영역 8,9의 내부 및 외부에서 정량화될 수 있습니다. 이것은 허혈 후 손상된 뇌 조직의 산소 수준을 나타낼 수 있기 때문에 허혈성 뇌졸중에서 중요한 척도입니다.
음향 혈관조영술(Acoustic angiography, AA)은 생체 내에서 맥관 구조의 형태를 영상화하는데 특히 유용한 조영증강 초음파 영상법이다 10. 이 방법은 이미징 대상의 순환계에 주입된 미세 기포와 함께 이중 요소 워블러 변환기(저주파 요소 및 고주파 요소)의 사용에 의존합니다. 트랜스듀서의 저주파 소자는 마이크로버블의 공진 주파수(예를 들어, 2MHz)로 전송하기 위해 사용되는 반면, 고주파 소자는 마이크로버블의 초고조파 신호(예를 들어, 26MHz)를 수신하기 위해 사용된다. 공진 주파수에서 여기될 때, 마이크로버블은 강한 비선형 반응을 가지며, 그 결과 주변 신체 조직이 생성하지 않는 초고조파 신호가 생성된다11. 고주파 소자로 수신함으로써 마이크로 버블 신호만 감지할 수 있습니다. 미세 기포가 혈관에 국한되어 있기 때문에 결과는 혈관 형태의 혈관 조영 이미지입니다. AA는 순환계를 통해 흐르는 미세 기포가 막힌 혈관을 통해 흐를 수 없기 때문에 허혈성 뇌졸중을 영상화하는 강력한 방법입니다. 이를 통해 AA는 경색 영역을 나타내는 허혈성 뇌졸중으로 인해 관류되지 않은 뇌 영역을 감지할 수 있습니다.
전임상 허혈성 뇌졸중 연구는 일반적으로 뇌졸중의 위치와 중증도를 평가하기 위해 조직학 및 행동 검사를 사용합니다. 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색은 뇌졸중 경색 부피를 측정하는 데 사용되는 일반적인 조직학적 분석입니다. 그러나, 동물을 안락사시켜야 하기 때문에 종점에서만 사용할 수 있다12. 행동 검사는 여러 시점에서 운동 기능 장애를 판정하는 데 사용될 수 있지만, 정량적인 해부학적 또는 생리학적 값을 제공할 수는 없다13. 생물 의학 영상은 허혈성 뇌졸중의 영향을 비침습적 및 세로적으로 연구하기 위한 보다 정량적인 접근 방식을 제공합니다 9,14,15. 그러나 기존 이미징 기술(예: 소동물 자기 공명 영상[MRI])은 비용이 많이 들거나 구조적 및 기능적 정보를 동시에 제공할 수 없거나 침투 깊이가 제한될 수 있습니다(대부분의 광학 이미징 기술).
여기에서는 광음향, 초음파 및 혈관 조영 단층 촬영(PAUSAT, 그림 1의 시스템 다이어그램 참조)을 결합하여 허혈성 뇌졸중 후 혈액 관류 및 산소 공급에 대한 보완적인 구조적 및 기능적 정보를 제공합니다16. 이는 부상의 심각성을 평가하고 치료에 대한 회복 또는 반응을 모니터링하는 데 있어 두 가지 중요한 측면입니다. 이러한 통합 이미징 방법을 사용하면 각 동물이 얻는 정보의 양을 증가시켜 필요한 동물의 수를 줄이고 허혈성 뇌졸중에 대한 잠재적 치료법 연구에서 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다.
그림 1: PAUSAT 다이어그램. (A) PAT에 사용되는 레이저 및 OPO를 포함한 PAUSAT 시스템의 전체 개략도. (B) 두 개의 초음파 변환기를 포함한 PAUSAT 시스템의 내부 모습. 이중 소자 워블러 트랜스듀서는 B 모드 초음파와 AA 모두에 사용되며 선형 배열 트랜스듀서는 PAT에 사용됩니다. 두 트랜스듀서 모두 동일한 2D 전동 스테이지에 장착되어 스캔을 통해 체적 데이터를 생성할 수 있습니다. 이 수치는16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법에는 잘못 수행할 경우 이미지 품질과 정량 분석이 크게 저하될 수 있는 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. PAUSAT 이미지에서 사용자 오류의 가장 일반적으로 발생하는 결과는 신호 부족 또는 매우 낮은 신호 강도이며, 둘 다 다양한 이유로 발생할 수 있습니다. 그러한 이유 중 하나는 음향 커플 링의 문제입니다. 이미징 중 마우스 머리를 둘러싼 물의 큰 기포는 종종 초음파가 변환기로 이동?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술 지원에 대해 SonoVol Inc.의 엔지니어링 팀에 감사드립니다. 이 연구는 미국 심장 협회 협력 과학 상 (18CSA34080277)이 J. Yao와 W. Yang에게 부분적으로 후원했습니다. 미국 국립 보건원 (NIH)은 R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (BRAIN Initiative), R01 NS111039, R01 EB028143; 미국 국립 과학 재단 (NSF) CAREER 상 2144788; Chan Zuckerberg Initiative Grant (2020-226178), J. Yao에게; NIH는 W. Yang에게 R21NS127163와 R01NS099590 부여합니다.
Materials
| 20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
| 532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
| Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
| Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
| C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
| Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
| Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
| Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
| Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
| Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
| Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
| High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
| IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
| Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
| Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
| Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
| Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
| Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
| Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
| Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
| Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
| Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
| VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |
References
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 87 (1), 179-197 (2007).
- Vander Worp, H. B., van Gijn, J. Clinical Practice. Acute ischemic stroke. The New England Journal of Medicine. 357 (6), 572-579 (2007).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch’s 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Hochrainer, K., Yang, W. Stroke proteomics: from discovery to diagnostic and therapeutic applications. Circulation Research. 130 (8), 1145-1166 (2022).
- Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nature Methods. 13 (8), 627-638 (2016).
- Aldrich, J. E. Basic physics of ultrasound imaging. Critical Care Medicine. 35 (5), S131-S137 (2007).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37-R61 (2013).
- Li, M., Tang, Y., Yao, J. Photoacoustic tomography of blood oxygenation: a mini review. Photoacoustics. 10, 65-73 (2018).
- Menozzi, L., Yang, W., Feng, W., Yao, J. Sound out the impaired perfusion: Photoacoustic imaging in preclinical ischemic stroke. Frontiers in Neuroscience. 16, 1055552 (2022).
- Gessner, R. C., Frederick, C. B., Foster, F. S., Dayton, P. A. Acoustic angiography: a new imaging modality for assessing microvasculature architecture. International Journal of Biomedical Imaging. 2013, 936593 (2013).
- Dayton, P. A., Rychak, J. J. Molecular ultrasound imaging using microbubble contrast agents. Frontiers in Bioscience. 12, 5124-5142 (2007).
- Isayama, K., Pitts, L. H., Nishimura, M. C. Evaluation of 2, 3, 5-triphenyitetrazolium chloride staining to delineate rat brain infarcts. Stroke. 22 (11), 1394-1398 (1991).
- Ruan, J., Yao, Y. Behavioral tests in rodent models of stroke. Brain Hemorrhages. 1 (4), 171-184 (2020).
- Parthasarathy, A. B., Kazmi, S. M. S., Dunn, A. K. Quantitative imaging of ischemic stroke through thinned skull in mice with Multi Exposure Speckle Imaging. Biomedical Optics Express. 1 (1), 246-259 (2010).
- Hingot, V., et al. Early ultrafast ultrasound imaging of cerebral perfusion correlates with ischemic stroke outcomes and responses to treatment in mice. Theranostics. 10 (17), 7480-7491 (2020).
- Menozzi, L., et al. Three-dimensional non-invasive brain imaging of ischemic stroke by integrated photoacoustic, ultrasound and angiographic tomography (PAUSAT). Photoacoustics. 29, 100444 (2022).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments. (89), e51729 (2014).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
- Labat-Gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments. (76), e50370 (2013).
- Matsumoto, Y., et al. Visualising peripheral arterioles and venules through high-resolution and large-area photoacoustic imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14930 (2018).
- Xu, Y., Wang, L. V., Ambartsoumian, G., Kuchment, P. Reconstructions in limited-view thermoacoustic tomography. Medical Physics. 31 (4), 724-733 (2004).
- Yal Tang, ., et al. High-fidelity deep functional photoacoustic tomography enhanced by virtual point sources. Photoacoustics. 29, 100450 (2023).
- Zheng, W., Huang, C., Zhang, H., Xia, J. Slit-based photoacoustic tomography with co-planar light illumination and acoustic detection for high-resolution vascular imaging in human using a linear transducer array. Biomedical Engineering Letters. 12 (2), 125-133 (2022).
- Wang, Y., et al. Slit-enabled linear-array photoacoustic tomography with near isotropic spatial resolution in three dimensions. Optics Letters. 41 (1), 127-130 (2016).
- Vu, T., Li, M., Humayun, H., Zhou, Y., Yao, J. A generative adversarial network for artifact removal in photoacoustic computed tomography with a linear-array transducer. Experimental Biology and Medicine. 245 (7), 597-605 (2020).
- Zhang, H., et al. Deep-E: A fully-dense neural network for improving the elevation resolution in linear-array-based photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (5), 1279-1288 (2022).
- Hauptmann, A., et al. Model-based learning for accelerated, limited-view 3-D photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (6), 1382-1393 (2018).
- Li, M., et al. Three-dimensional deep-tissue functional and molecular imaging by integrated photoacoustic, ultrasound, and angiographic tomography (PAUSAT). IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (10), 2704-2714 (2022).
