מתנול יכול לשמש כמדיום עזר קבוע עבור תכשירים ברשתית שלמות הר אחסון לטווח ארוך, אשר שימושי לחקירה של תאי גנגליון ברשתית.
תאי גנגליון ברשתית (RGCs), שהם נוירוני ההקרנה של הרשתית, מפיצים מידע חזותי חיצוני למוח. לשינויים פתולוגיים ב- RGCs יש קשר הדוק עם מחלות ניווניות רבות ברשתית. Whole-mount retinal immunostaining משמש לעתים קרובות במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את התנאים ההתפתחותיים והפתולוגיים של הרשתית. בנסיבות מסוימות, ייתכן שיהיה צורך לשמור כמה דגימות רשתית יקרות ערך, כגון אלה מעכברים טרנסגניים, לתקופה ארוכה מבלי להשפיע על המורפולוגיה או על מספר RGCs. לקבלת תוצאות ניסוי אמינות וניתנות לשחזור, שימוש במדיום שימור יעיל הוא חיוני. כאן, אנו מתארים את ההשפעה של מתנול כאמצעי עזר קבוע עבור תכשירים רשתית מלאה ואחסון לטווח ארוך. בקצרה, במהלך תהליך הבידוד, מתנול קר (-20 ° C) הוא pipeted על פני השטח של הרשתית כדי לעזור לתקן את הרקמות ולהקל על החדירות שלהם, ולאחר מכן הרשתית ניתן לאחסן מתנול קר (-20 ° C) לפני להיות immunostained. פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה של בידוד הרשתית ואת פרוטוקול אחסון דגימות הרקמות, שהוא שימושי ומעשי לחקירת RGCs.
תאי גנגליון ברשתית (RGCs) הם נוירוני ההקרנה היחידים ברשתית, והם משתלבים ומעבירים מידע חזותי חיצוני למוח1. מחלות נוירודגנרטיביות רבות כגון גלאוקומה ונוירופתיה אופטית טראומטית מאופיינות בנזק בלתי הפיך ואובדן RGCs 2,3. ניתוח השינויים המורפולוגיים והכמותיים של RGCs הוא צעד מכריע בקביעת האופן שבו מחלות נוירודגנרטיביות מתפתחות ומתקדמות 4,5.
בדיקת אימונופלואורסנציה עקיפה היא שיטה מקובלת לניטור התפלגות החלבונים וספירת התאים. במעבדה, אימונוסטיין רשתית מלאה משמש בדרך כלל במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של הרשתית6. הסמנים הנפוצים ביותר המשמשים לכימות RGC בכל הרשתית כוללים Brn3a, חלבון קושר RNA עם שחבור מרובה (RBPMS), וכן הלאה 7,8. אפיון הכמות והפיזור של RGCs דורש אימונוסטיין רשתית באיכות גבוהה. בדרך כלל, בפרוטוקולים של אימונוסטינינג, הרשתית שקועה בקיבועים כימיים לפני שהיא מודגרת בנוגדנים. קיבועים אידיאליים לא צריכים לשנות את צורת התאים, את הנגישות או הזיקה של האפיטופים לנוגדנים, או את הממדים הליניאריים של הרקמה 9,10.
בשל המבנה המורכב של הרשתית, בעיות כגון שבריריות רשתית וקיפול, כמו גם כמה קשיים נפוצים כולל התכווצות תאים וגרעינים לא ברורים, נוטים להתרחש בעת ביצוע תיקון רשתית שלם, אשר יש השפעה שלילית על מחקר ניסיוני. בנוסף, לא כל הרשתיות עוברות חיסון מיידי, במיוחד כשמדובר ברשתיות של עכברים טרנסגניים עם מחירים יקרים שמקורם יקר, מה שמחייב שימור דגימות הרשתית הנוספות לשימוש נוסף.
הפתרון המקבע המתאים יכול לתקן את הרקמה במהירות, להימנע מאוטוליזה של רקמות, לשמר את המורפולוגיה והמבנה הרגילים של תאי הרקמה, ולשמור על האנטיגניות של חלבונים וחומרים אחרים10. נכון לעכשיו, קיבוע מבוסס פורמלדהיד נמצא בשימוש נרחב ברקמות שונות, כולל רשתיות מופרדות, משקפיים hemisected, וגלגלי עיניים שלמים10. התכווצות רקמות ושינוי מורפולוגי של תאים הם שני האתגרים הקריטיים שנתקלים בהם בעקבות טבילה בפורמלדהיד11. בנוסף, ניסוחי קיבוע מותאמים צצים יותר ויותר כדי למקסם את השמירה על המאפיינים המקוריים של הרשתית ותאי היעד 9,10. טיפולים שונים בקיבוע רשתית עשויים להשפיע על מבנה הרשתית, אימונוגניות חלבון, עירור פלואורסצנטי , ומחזור מרווה הנחתה באופן שונה12,13. הרשתיות המקובעות בתמיסה של דוידסון שלמות יותר מבחינה מורפולוגית בהשוואה לאלה המקובעות בפורמלין, אך התמיסה של דוידסון פחות תואמת לנוגדנים מסוימים, כגון מולקולת מתאם קשירת סידן 112 של סמן מיקרוגליה. בהתחשב באופי השברירי של הרשתית, החוקרים יתהו באופן טבעי אם שלמות הרשתית, כמו גם התכונות והמורפולוגיה של תאי המטרה, ישתנו לאחר אחסון לטווח ארוך. עם זאת, ההשפעות האפשריות של תמיסת קיבוע על המורפולוגיה של תאי הרשתית וה-RGC לאחר אחסון במשך מספר חודשים דווחו רק לעתים רחוקות. אופטימיזציה של קיבוע הרשתית היא קריטית להערכה ושימור של RGCs.
אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה אמינה ופשוטה מבחינה טכנית בה אנו משתמשים לצביעת רשתית מורין בהרכבה שלמה. השיטה שלנו שמה דגש על הכנה ואחסון נכונים של רשתיות לחקירת RGC, תוך התחשבות בצורך באחסון לטווח ארוך של רקמת הרשתית וכן היבטים ספציפיים של היווצרות פלואורופור או התפרקות.
קיבוע הוא צעד חיוני לשימור הרשתית, אשר יכול להשפיע על כל חקירות RGC הבאות המבוססות על מורפולוגיה. קיבוע מוצלח לוכד במהירות את המבנה והמצב של הרשתיות ברגע חשיפתן למדיום הקיבוע, שהוא קריטי לניתוח נוסף. למרות שפורמלדהיד נחשב לאחד מסוכני הקיבוע הנפוצים ביותר לקיבוע ושימור רקמות ותאים, פורמלדהי…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי פרויקט פתיחת מעבדות מפתח חוביי (מענק מס ‘2021KFY055), הקרן למדעי הטבע של מחוז חוביי (מענק מס ‘2020CFB240), וקרנות מחקר בסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות (מענק מס ‘2042020kf0065).
24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |