Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen
Summary
Methanol kann als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung verwendet werden, was für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen nützlich ist.
Abstract
Retinale Ganglienzellen (RGCs), die Projektionsneuronen der Netzhaut, leiten externe visuelle Informationen an das Gehirn weiter. Pathologische Veränderungen der RGCs stehen in engem Zusammenhang mit zahlreichen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut. Die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut wird häufig in experimentellen Studien an RGCs eingesetzt, um die Entwicklungs- und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten. Unter bestimmten Umständen müssen einige wertvolle Netzhautproben, z. B. von transgenen Mäusen, über einen langen Zeitraum aufbewahrt werden, ohne die Morphologie oder Anzahl der RGCs zu beeinträchtigen. Für glaubwürdige und reproduzierbare experimentelle Ergebnisse ist die Verwendung eines effektiven Konservierungsmediums unerlässlich. Hier beschreiben wir die Wirkung von Methanol als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung. Kurz gesagt, während des Isolationsprozesses wird kaltes Methanol (−20 °C) auf die Oberfläche der Netzhaut pipettiert, um das Gewebe zu fixieren und seine Durchlässigkeit zu erleichtern, und dann kann die Netzhaut in kaltem Methanol (−20 °C) gelagert werden, bevor sie immungefärbt wird. Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf für die Netzhautisolierung und die Lagerung von Gewebeproben, die für die Untersuchung von RGCs nützlich und praktisch sind.
Introduction
Retinale Ganglienzellen (RGCs) sind die einzigen Projektionsneuronen in der Netzhaut, und sie integrieren und übertragen visuelle Informationen von außen an das Gehirn1. Viele neurodegenerative Erkrankungen wie das Glaukom und die traumatische Optikusneuropathie sind durch irreversible Schädigung und Verlust von RGCs gekennzeichnet 2,3. Die Analyse der morphologischen und quantitativen Veränderungen von RGCs ist ein entscheidender Schritt, um zu bestimmen, wie neurodegenerative Erkrankungen entstehen und fortschreiten 4,5.
Der indirekte Immunfluoreszenz-Assay ist eine weithin anerkannte Methode zur Überwachung der Verteilung von Proteinen und der Zellzählung. Im Labor wird die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut häufig in experimentellen Studien an RGCs verwendet, um die physiologischen und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten6. Zu den gebräuchlichsten Markern, die für die RGC-Quantifizierung in der gesamten Netzhaut verwendet werden, gehören Brn3a, RNA-bindendes Protein mit multiplem Spleißen (RBPMS) usw. 7,8. Die Charakterisierung der Menge und Verteilung von RGCs erfordert eine qualitativ hochwertige Immunfärbung der gesamten Netzhaut. Im Allgemeinen wird die Netzhaut bei Immunfärbeprotokollen in chemische Fixiermittel getaucht, bevor sie in Antikörpern inkubiert wird. Ideale Fixiermittel sollten die Form der Zellen, die Zugänglichkeit oder Affinität der Epitope für Antikörper oder die linearen Abmessungen des Gewebes nicht verändern 9,10.
Aufgrund der komplexen Struktur der Netzhaut treten bei der Herstellung eines Whole-Mount-Netzhautpflasters häufig Probleme wie Fragilität und Faltung der Netzhaut sowie einige häufige Schwierigkeiten wie Zellschrumpfung und unklare Zellkerne auf, was sich negativ auf die experimentelle Forschung auswirkt. Darüber hinaus werden nicht alle Netzhäute sofort immungefärbt, insbesondere wenn es sich um die Netzhaut von transgenen Mäusen handelt, die zu teuren Preisen wertvoller Herkunft sind, was die Konservierung der zusätzlichen Netzhautproben für die weitere Verwendung erforderlich macht.
Die geeignete Fixierlösung kann das Gewebe schnell fixieren, eine Gewebeautolyse vermeiden, die normale Morphologie und Struktur der Gewebezellen erhalten und die Antigenität von Proteinen und anderen Substanzen erhalten10. Gegenwärtig wird die Fixierung auf Formaldehydbasis häufig in verschiedenen Geweben eingesetzt, darunter getrennte Netzhaut, halbgeschnittene Augenmuscheln und ganze Augäpfel10. Die Schrumpfung des Gewebes und die morphologische Veränderung von Zellen sind die beiden entscheidenden Herausforderungen, die nach dem Eintauchen in Formaldehydauftreten 11. Darüber hinaus werden zunehmend modifizierte Fixierungsformulierungen entwickelt, um die Erhaltung der ursprünglichen Eigenschaften der Netzhaut und der Zielzellen zu maximieren 9,10. Verschiedene Netzhautfixationsbehandlungen können die Netzhautstruktur, die Proteinimmunogenität, die Fluoreszenzanregung und den Abschwächungslöschzyklus unterschiedlich beeinflussen12,13. Netzhäute, die mit Davidson-Lösung fixiert wurden, sind morphologisch intakter als solche, die mit Formalin fixiert wurden, aber Davidsons Lösung ist weniger kompatibel mit einigen Antikörpern, wie z. B. dem Mikroglia-Marker-ionisierten Kalzium-bindenden Adaptermolekül 112. Angesichts der Zerbrechlichkeit der Netzhaut würden sich die Forscher natürlich fragen, ob sich die Integrität der Netzhaut sowie die Eigenschaften und die Morphologie der Zielzellen nach längerer Lagerung verändern werden. Über die möglichen Auswirkungen der Fixierlösung auf die Morphologie der Netzhaut und der RGC-Zellen nach mehrmonatiger Lagerung wurde jedoch nur selten berichtet. Die Optimierung der Netzhautfixierung ist entscheidend für die Beurteilung und Erhaltung von RGCs.
Wir bieten eine detaillierte Beschreibung einer zuverlässigen und technisch unkomplizierten Methode, die wir für die Total-Mount-Färbung der murinen Netzhaut verwenden. Unsere Methode legt den Schwerpunkt auf die richtige Präparation und Lagerung von Netzhäuten für die RGC-Untersuchung, wobei die Notwendigkeit der Langzeitlagerung von Netzhautgewebe sowie spezifische Aspekte der Fluorophorbildung oder des Fluorophorabbaus berücksichtigt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fixierung ist ein wesentlicher Schritt zur Erhaltung der Netzhaut, der sich auf nachfolgende RGC-Untersuchungen auf der Grundlage der Morphologie auswirken kann. Eine erfolgreiche Fixation erfasst schnell die Struktur und den Zustand der Netzhaut in dem Moment, in dem sie dem Fixiermedium ausgesetzt wird, was für die weitere Analyse entscheidend ist. Obwohl Formaldehyd als eines der gebräuchlichsten Fixiermittel für die Fixierung und Konservierung von Gewebe und Zellen angesehen wird, eignet sich Formaldehyd allei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Hubei Key Laboratories Opening Project (Zuschussnummer 2021KFY055), die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Hubei (Zuschussnummer 2020CFB240) und den Fonds für Grundlagenforschung für die zentralen Universitäten (Zuschussnummer 2042020kf0065) finanziert.
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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