Preparato a base di metanolo a montaggio intero per lo studio delle cellule gangliari retiniche

Le cellule gangliari retiniche (RGC) sono gli unici neuroni di proiezione nella retina e integrano e trasmettono informazioni visive esterne al cervello¹. Molte malattie neurodegenerative come il glaucoma e la neuropatia ottica traumatica sono caratterizzate da danni irreversibili e perdita di RGC ^2,3. L’analisi dei cambiamenti morfologici e quantitativi delle RGC è un passo cruciale nel determinare come le malattie neurodegenerative si sviluppano e avanzano ^4,5.

Il saggio di immunofluorescenza indiretta è un metodo ampiamente accettato per monitorare la distribuzione delle proteine e il conteggio delle cellule. In laboratorio, l’immunocolorazione retinica a montaggio intero è comunemente utilizzata negli studi sperimentali sulle RGC per valutare le condizioni fisiologiche e patologiche della retina⁶. I marcatori più comuni utilizzati per la quantificazione RGC nell’intera retina includono Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), e così via ^7,8. La caratterizzazione della quantità e della distribuzione delle RGC richiede un’immunocolorazione retinica a montaggio intero di alta qualità. Generalmente, nei protocolli di immunocolorazione, la retina viene immersa in fissativi chimici prima di essere incubata in anticorpi. I fissativi ideali non dovrebbero cambiare la forma delle cellule, l’accessibilità o l’affinità degli epitopi per gli anticorpi o le dimensioni lineari del tessuto ^9,10.

A causa della complessa struttura della retina, problemi come la fragilità e il ripiegamento della retina, così come alcune difficoltà comuni tra cui il restringimento delle cellule e nuclei poco chiari, sono inclini a verificarsi quando si realizza un cerotto retinico a montaggio intero, che ha un impatto negativo sulla ricerca sperimentale. Inoltre, non tutte le retine sono immunocolorate immediatamente, specialmente quando si tratta di retine di topi transgenici con prezzi costosi che sono di origine preziosa, rendendo necessaria la conservazione dei campioni retinici extra per un ulteriore utilizzo.

La soluzione fissativa appropriata può fissare rapidamente il tessuto, evitare l’autolisi tissutale, preservare la normale morfologia e struttura delle cellule tissutali e mantenere l’antigenicità delle proteine e di altre sostanze¹⁰. Allo stato attuale, la fissazione a base di formaldeide è stata ampiamente utilizzata in vari tessuti, tra cui retine separate, conchiglie oculari emisecate e bulbi oculari interi¹⁰. Il restringimento tissutale e l’alterazione morfologica delle cellule sono le due sfide critiche incontrate dopo l’immersione in formaldeide¹¹. Inoltre, stanno emergendo sempre più formulazioni di fissazione modificate per massimizzare la conservazione delle proprietà originali della retina e delle cellule bersaglio ^9,10. Diversi trattamenti di fissazione retinica possono influenzare la struttura retinica, l’immunogenicità delle proteine, l’eccitazione della fluorescenza e il ciclo di tempra dell’attenuazione in modo diverso^12,13. Le retine fissate con la soluzione di Davidson sono morfologicamente più intatte rispetto a quelle fissate con formalina, ma la soluzione di Davidson è meno compatibile con alcuni anticorpi, come la molecola 1¹² dell’adattatore legante il calcio ionizzato con marcatore microgliale. Considerando la natura fragile delle retine, i ricercatori si chiederanno naturalmente se l’integrità della retina, così come le proprietà e la morfologia delle cellule bersaglio, cambieranno dopo la conservazione a lungo termine. Tuttavia, i possibili effetti della soluzione di fissazione sulla morfologia delle cellule retiniche e RGC dopo la conservazione per diversi mesi sono stati raramente riportati. L’ottimizzazione della fissazione retinica è fondamentale per la valutazione e la conservazione delle RGC.

Forniamo una descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per la colorazione retinica murina a montaggio intero. Il nostro metodo enfatizza la corretta preparazione e conservazione delle retine per l’indagine RGC, tenendo conto della necessità di conservazione a lungo termine del tessuto retinico e degli aspetti specifici della formazione o della degradazione dei fluorofori.