Настоящий протокол подготавливает и оценивает физические свойства, иммунный ответ и защитный эффект in vivo новой наноэмульсионной адъювантной вакцины.
Наноэмульсионные адъювантные вакцины привлекли большое внимание из-за их небольшого размера частиц, высокой термической стабильности и способности вызывать иммунные реакции. Тем не менее, создание ряда всеобъемлющих протоколов для оценки иммунного ответа новой наноэмульсионной адъювантной вакцины имеет жизненно важное значение. Таким образом, в этой статье представлена строгая процедура определения физико-химических характеристик вакцины (с помощью просвечивающей электронной микроскопии [TEM], атомно-силовой микроскопии [AFM] и динамического рассеяния света [DLS]), стабильности антигена и системы вакцины (с помощью высокоскоростного центрифужного теста, теста термодинамической стабильности, SDS-PAGE и вестерн-блоттинга) и специфического иммунного ответа (IgG1, IgG2a и IgG2b). Используя этот подход, исследователи могут точно оценить защитный эффект новой наноэмульсионной адъювантной вакцины на летальной модели MRSA252 мыши. С помощью этих протоколов может быть идентифицирован наиболее перспективный адъювант для наноэмульсионной вакцины с точки зрения эффективного адъювантного потенциала. Кроме того, эти методы могут помочь оптимизировать новые вакцины для будущей разработки.
Метициллин-резистентный золотистый стафилококк (MRSA) является условно-патогенным микроорганизмом с одним из самых высоких показателей инфицирования в отделенияхинтенсивной терапии (ОИТ) 1, кардиологических отделениях и ожоговых отделениях во всем мире. MRSA демонстрирует высокие показатели инфицирования, смертности и широкой лекарственной устойчивости, что представляет большие трудности в клиническом лечении2. В Глобальном приоритетном списке устойчивых к антибиотикам бактерий, опубликованном Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 2017 году, MRSA был включен в наиболее критическую категорию3. Поэтому срочно необходима вакцина против инфекции MRSA.
Алюминиевый адъювант используется уже давно, а вспомогательный механизм адъюванта относительно чист, безопасен, эффективен и хорошо переносится4. Алюминиевые адъюванты в настоящее время являются широко используемым типом адъюванта. Обычно считается, что антигены, адсорбированные на частицах соли алюминия, могут улучшить стабильность и повысить способность места инъекции поглощать антигены, обеспечивая хорошую абсорбцию и медленное высвобождение5. В настоящее время основным недостатком алюминиевых адъювантов является то, что они не обладают адъювантным эффектом или проявляют лишь слабое адъювантное действие на некоторые антигены-кандидаты в вакцину6. Кроме того, алюминиевые адъюванты индуцируют IgE-опосредованные реакции гиперчувствительности5. Поэтому необходимо разработать новые адъюванты для стимуляции более сильного иммунного ответа.
Наноэмульсионные адъюванты представляют собой коллоидные дисперсионные системы, состоящие из масла, воды, поверхностно-активных веществ и поверхностно-активных веществ7. Кроме того, адъюванты являются термодинамически стабильными и изотропными, могут быть автоклавированы или стабилизированы высокоскоростным центрифугированием и могут образовываться спонтанно в мягких условиях приготовления. Несколько эмульсионных адъювантов (таких как серии MF59, NB001-002, AS01-04 и т. д.) в настоящее время представлены на рынке или находятся на стадии клинических исследований, но их размеры частиц превышают 160нм 8. Следовательно, преимущества наноразмерных (1-100 нм) лекарственных препаратов (т.е. большая удельная поверхность, малый размер частиц, поверхностный эффект, высокая поверхностная энергия, эффект малого размера и эффект макроквантового туннелирования) не могут быть полностью использованы. В настоящем протоколе сообщается, что новый адъювант, основанный на технологии наноэмульсии, с размером диаметра 1-100 нм проявляет хорошую адъювантную активность9. Мы протестировали белок антигена вакцины рекомбинационной субъединицы HI (мутант α-гемолизина [Hla] и ион Fe, определяющий поверхностный фактор B [IsdB], субъединица N2, белок слияния активных фрагментов N2); Был создан ряд процедур для изучения физических свойств и стабильности, оценки ее специфического ответа антител после внутримышечного введения и проверки защитного эффекта вакцины с использованием модели системной инфекции мыши.
IsdB, поверхностный белок, закрепленный на клеточной стенке бактерий и регулируемый железом, играет важную роль в процессе получения гемового железа15. Hla, альфа-токсин, является одним из наиболее эффективных бактериальных токсинов, известных в MRSA, и может образовыв?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано No 2021YFC2302603 Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая, No 32070924 и 32000651 NSFC и No 2019jcyjA-msxmx0159 Проектной программы Фонда естественных наук Чунцина.
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
Gel image | Tanon, USA | null | |
Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
MRSA252 | USA, ATCC | null | |
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
PBS | biosharp, China | null | |
PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |