メチシリン耐性 黄色ブドウ球菌 (MRSA)感染に対するナノエマルジョンアジュバントワクチンの免疫応答の評価
Summary
本プロトコルは、新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンの物理的特性、免疫応答、および インビボ 防御効果を調製および評価する。
Abstract
ナノエマルジョンアジュバントワクチンは、その小さな粒子サイズ、高い熱安定性、および有効な免疫応答を誘導する能力のために広く注目を集めている。しかし、新しいナノエマルジョンアジュバントワクチンの免疫応答を評価するための一連の包括的なプロトコルを確立することが不可欠です。したがって、この記事では、ワクチンの物理化学的特性(透過型電子顕微鏡[TEM]、原子間力顕微鏡[AFM]、および動的光散乱[DLS]による)、ワクチン抗原およびシステムの安定性(高速遠心分離試験、熱力学的安定性試験、SDS-PAGE、およびウェスタンブロットによる)、および特異的免疫応答(IgG1、 IgG2a、およびIgG2b)。このアプローチを使用して、研究者は、致死MRSA252マウスモデルにおける新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンの保護効果 を正確に評価することができる。これらのプロトコルにより、有効なアジュバントの可能性の観点から最も有望なナノエマルジョンワクチンアジュバントを同定することができる。さらに、この方法は、将来の開発のために新しいワクチンを最適化するのに役立ちます。
Introduction
メチシリン耐性 黄色ブドウ球菌 (MRSA)は、世界中の集中治療室(ICU)病棟1、心臓病科、および火傷科で最も高い感染率の1つである日和見病原体です。MRSAは感染率、死亡率が高く、薬剤耐性が広く、臨床治療において大きな困難を示しています2。2017年に世界保健機関(WHO)が発表した抗生物質耐性菌のグローバル優先リストでは、MRSAは最も重要なカテゴリー3にリストされました。したがって、MRSA感染に対するワクチンが緊急に必要とされています。
アルミニウムアジュバントは長い間使用されており、アジュバント補助メカニズムは比較的明確で、安全で、効果的で、忍容性が良好です4。アルミニウムアジュバントは、現在広く使用されているタイプのアジュバントである。一般に、アルミニウム塩粒子に吸着された抗原は、安定性を改善し、注射部位が抗原を取り込む能力を高め、良好な吸収と徐放を提供すると考えられています5。現在、アルミニウムアジュバントの主な欠点は、アジュバント効果を欠くか、またはいくつかのワクチン候補抗原に対して弱いアジュバント効果しか示さないことである6。さらに、アルミニウムアジュバントはIgEを介した過敏反応を誘導します5。したがって、より強力な免疫応答を刺激するための新規アジュバントを開発する必要があります。
ナノエマルジョンアジュバントは、油、水、界面活性剤、および共界面活性剤7で構成されるコロイド分散系である。さらに、アジュバントは熱力学的に安定で等方性であり、オートクレーブ処理または高速遠心分離による安定化が可能で、穏やかな調製条件下で自発的に形成することができます。いくつかのエマルジョンアジュバント(MF59、NB001-002シリーズ、AS01-04シリーズなど)が現在市場に出回っているか、臨床研究段階にありますが、それらの粒子サイズは160nmを超えています8。したがって、ナノスケール(1〜100 nm)の医薬品の利点(すなわち、大きな比表面積、小さな粒子サイズ、表面効果、高い表面エネルギー、小さなサイズの効果、およびマクロ量子トンネル効果)を十分に活用することはできません。本プロトコールでは、直径サイズ1〜100nmのナノエマルジョン技術に基づく新規アジュバントが良好なアジュバント活性を示すことが報告されている9。組換えサブユニットワクチン抗原タンパク質HI(α-ヘモリシン変異体[Hla]およびFeイオン表面決定因子B[IsdB]サブユニットN2活性断片融合タンパク質)をテストしました。物性や安定性の検討、筋肉内投与後の特異的抗体応答の評価、マウス全身感染モデルを用いたワクチンの防御効果の試験など、一連の手順を確立した。
Protocol
Representative Results
Discussion
細菌の細胞壁に固定され、鉄で調節された表面タンパク質であるIsdBは、ヘム鉄15を得るプロセスにおいて重要な役割を果たします。アルファ毒素であるHlaは、MRSAで知られている最も効果的な細菌毒素の1つであり、真核細胞に細孔を形成し、接着および上皮細胞を妨害する可能性があります16。本研究では、IsdBとHlaの抗原遺伝子?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国の国家重点研究開発プログラムのNo.2021YFC2302603、NSFCの第32070924および32000651、および重慶の自然科学財団プロジェクトプログラムのNo.2019jcyjA-msxmx0159によってサポートされました。
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
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