Évaluation de la réponse immunitaire d’un vaccin adjuvant à base de nanoémulsion contre l’infection à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)
Summary
Le présent protocole prépare et évalue les propriétés physiques, la réponse immunitaire et l’effet protecteur in vivo d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion.
Abstract
Les vaccins adjuvants à base de nanoémulsion ont attiré beaucoup d’attention en raison de leur petite taille de particules, de leur stabilité thermique élevée et de leur capacité à induire des réponses immunitaires valides. Cependant, il est essentiel d’établir une série de protocoles complets pour évaluer la réponse immunitaire d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion. Par conséquent, cet article présente une procédure rigoureuse pour déterminer les caractéristiques physico-chimiques d’un vaccin (par microscopie électronique à transmission [MET], microscopie à force atomique [AFM] et diffusion dynamique de la lumière [DLS]), la stabilité de l’antigène et du système vaccinaux (par un test de centrifugeuse à grande vitesse, un test de stabilité thermodynamique, SDS-PAGE et Western blot), et la réponse immunitaire spécifique (IgG1, IgG2a et IgG2b). En utilisant cette approche, les chercheurs peuvent évaluer avec précision l’effet protecteur d’un nouveau vaccin adjuvant de nanoémulsion dans un modèle murin MRSA252 mortel. Avec ces protocoles, l’adjuvant de vaccin nanoémulsion le plus prometteur en termes de potentiel adjuvant efficace peut être identifié. En outre, les méthodes peuvent aider à optimiser les nouveaux vaccins pour le développement futur.
Introduction
Le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) est un pathogène opportuniste avec l’un des taux d’infection les plus élevés dans les unités de soins intensifs (USI) des services 1, les services de cardiologie et lesservices de brûlures du monde entier. Le SARM présente des taux élevés d’infection, de mortalité et de résistance générale aux médicaments, ce qui présente de grandes difficultés dans le traitement clinique2. Dans la liste prioritaire mondiale des bactéries résistantes aux antibiotiques publiée par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) en 2017, le SARM figurait dans la catégorie3 la plus critique. Un vaccin contre l’infection à SARM est donc nécessaire de toute urgence.
L’adjuvant d’aluminium est utilisé depuis longtemps et le mécanisme auxiliaire de l’adjuvant est relativement clair, sûr, efficace et bien toléré4. Les adjuvants à base d’aluminium sont actuellement un type d’adjuvant largement utilisé. On croit généralement que les antigènes adsorbés sur les particules de sel d’aluminium peuvent améliorer la stabilité et renforcer la capacité du site d’injection à absorber les antigènes, assurant une bonne absorption et une libération lente5. Actuellement, le principal inconvénient des adjuvants d’aluminium est qu’ils n’ont pas d’effet adjuvant ou ne présentent qu’un faible effet adjuvant sur certains antigènes candidats vaccins6. De plus, les adjuvants d’aluminium induisent des réactions d’hypersensibilité médiées par les IgE5. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouveaux adjuvants pour stimuler une réponse immunitaire plus forte.
Les adjuvants de nanoémulsion sont des systèmes de dispersion colloïdale composés d’huile, d’eau, de tensioactifs et de cosurfactants7. De plus, les adjuvants sont thermodynamiquement stables et isotropes, peuvent être autoclavés ou stabilisés par centrifugation à grande vitesse et peuvent se former spontanément dans des conditions de préparation douces. Plusieurs adjuvants d’émulsion (tels que MF59, série NB001-002, série AS01-04, etc.) sont actuellement sur le marché ou au stade de la recherche clinique, mais leur taille de particules est supérieure à 160 nm8. Par conséquent, les avantages des préparations médicinales à l’échelle nanométrique (1-100 nm) (c.-à-d. grande surface spécifique, petite taille de particules, effet de surface, énergie de surface élevée, effet de petite taille et effet tunnel macro-quantique) ne peuvent pas être pleinement exploités. Dans le protocole actuel, un nouvel adjuvant basé sur la technologie de nanoémulsion d’un diamètre de 1 à 100 nm a été signalé comme présentant une bonne activité adjuvante9. Nous avons testé la protéine antigénique du vaccin sous-unitaire de recombinaison HI (mutant de la α-hémolysine [Hla] et protéine de fusion de fragments actifs de la sous-unité N2 déterminant la surface des ions Fe ; Une série de procédures ont été établies pour examiner les propriétés physiques et la stabilité, évaluer sa réponse anticorps spécifique après administration intramusculaire et tester l’effet protecteur du vaccin à l’aide d’un modèle d’infection systémique chez la souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
IsdB, une protéine de surface ancrée dans la paroi cellulaire bactérienne et régulée par le fer, joue un rôle important dans le processus d’obtention du fer hémique15. Hla, toxine alpha, est parmi les toxines bactériennes les plus efficaces connues dans le SARM, et peut former des pores dans les cellules eucaryotes et interférer avec l’adhésion et les cellules épithéliales16. Dans notre étude, une nouvelle protéine antigénique SARM (IH) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par le n ° 2021YFC2302603 du Programme national de recherche et de développement clé de la Chine, n ° 32070924 et 32000651 du NSFC et le n ° 2019jcyjA-msxmx0159 du programme de projet de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
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