Summary

Genereren van genetisch gemodificeerde Plasmodium berghei Sporozoïeten

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

Malaria wordt overgedragen door inoculatie van het sporozoietstadium van Plasmodium door geïnfecteerde muggen. Transgeen Plasmodium heeft ons in staat gesteld de biologie van malaria beter te begrijpen en heeft rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van malariavaccins. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methodologie om transgene Plasmodium berghei sporozoïeten te genereren.

Abstract

Malaria is een dodelijke ziekte die wordt veroorzaakt door de parasiet Plasmodium en wordt overgedragen door de beet van vrouwelijke Anopheles-muggen . Het sporozoietstadium van Plasmodium dat door muggen in de huid van gewervelde gastheren wordt afgezet, ondergaat een fase van verplichte ontwikkeling in de lever voordat klinische malaria wordt geïnitieerd. We weten weinig over de biologie van de ontwikkeling van Plasmodium in de lever; toegang tot het sporozoietstadium en het vermogen om dergelijke sporozoïeten genetisch te modificeren zijn cruciale hulpmiddelen voor het bestuderen van de aard van Plasmodium-infectie en de resulterende immuunrespons in de lever. Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor het genereren van transgene Plasmodium berghei sporozoïeten. We modificeren P. berghei genetisch in het bloedstadium en gebruiken deze vorm om Anopheles-muggen te infecteren wanneer ze een bloedmaaltijd nemen. Nadat de transgene parasieten zich in de muggen hebben ontwikkeld, isoleren we het sporozoietstadium van de parasiet uit de speekselklieren van de mug voor in vivo en in vitro experimenten. We demonstreren de validiteit van het protocol door sporozoïeten te genereren van een nieuwe stam van P. berghei die het groen fluorescerende eiwit (GFP) subeenheid 11 (GFP11) tot expressie brengt, en laten zien hoe het kan worden gebruikt om de biologie van malaria in het leverstadium te onderzoeken.

Introduction

Ondanks de vooruitgang in de ontwikkeling van geneesmiddelen en onderzoek naar malariapreventie en -behandeling, blijft de wereldwijde ziektelast van malaria hoog. Elk jaar sterven meer dan een half miljoen mensen aan malaria, met de hoogste sterftecijfers onder kinderen die in malaria-endemische regio’s wonen,zoals Afrika ten zuiden van de Sahara. Malaria wordt veroorzaakt door de parasiet Plasmodium, die op mensen wordt overgedragen door de beet van vrouwelijke Anopheles-muggen die de parasiet in hun speekselklieren dragen. Het infectieuze stadium van Plasmodium – de sporozoïeten – wordt tijdens een bloedmaaltijd afgezet in de huid van de gewervelde gastheren en reist door de bloedbaan om levercellen te infecteren, waar ze een verplichte ontwikkeling ondergaan (pre-erytrocytaire malaria vormen) voordat ze de erytrocyten infecteren. De infectie van de erytrocyten initieert het bloedstadium van malaria en is verantwoordelijk voor het geheel van de morbiditeit en mortaliteit die met de ziekte gepaardgaan2,3.

De obligate aard van de pre-erytrocytaire ontwikkeling van Plasmodium heeft het tot een aantrekkelijk doelwit gemaakt voor profylactische inspanningen op het gebied van vaccin- engeneesmiddelenontwikkeling4. Een voorwaarde voor het bestuderen van de biologie van pre-erytrocytaire malaria, evenals de ontwikkeling van vaccins of geneesmiddelen gericht op het leverstadium, is toegang tot Plasmodium sporozoïeten. Bovendien heeft ons vermogen om genetisch gemodificeerde Plasmodium-sporozoïeten te genereren een belangrijke rol gespeeld in het succes van dergelijke onderzoeksinspanningen 5,6,7,8,9. Transgene Plasmodium-lijnen die fluorescerende of lichtgevende reportereiwitten tot expressie brengen, hebben ons in staat gesteld hun ontwikkeling in vivo en in vitro te volgen 10,11. Genetisch verzwakte parasieten (GAP’s), gegenereerd door de deletie van meerdere genen in Plasmodium, zijn ook enkele van de meest veelbelovende vaccinkandidaten12,13.

Malariamodellen van knaagdieren en niet-menselijke primaten hebben ons geholpen de mechanismen van gastheer-parasietinteracties bij menselijke malaria te begrijpen vanwege de overeenkomsten in biologie en levenscyclus tussen Plasmodium-soorten 14. Het gebruik van Plasmodium-soorten die knaagdieren infecteren, maar geen mensen (bijv. P. berghei) maakt het mogelijk om de volledige levenscyclus van parasieten te behouden en infectieuze sporozoïeten te genereren voor het bestuderen van malaria in het leverstadium in een gecontroleerde omgeving met bioveiligheidsniveau 1. Er bestaan al verschillende afzonderlijke protocollen voor het genereren van transgene Plasmodium-parasieten in het bloedstadium15, infectie van muggen 16 en isolatie van sporozoïeten17. Hier schetsen we een uitgebreid protocol dat deze methodologieën combineert om transgene P. berghei-sporozoïeten te genereren en te isoleren, met de nieuwe transgene stam PbGFP11 als voorbeeld. PbGFP 11 transporteert de 11e β-streng van super-folder groen fluorescerend eiwit (GFP), GFP11, naar de parasitofore vacuole (PV) die wordt gegenereerd in de hepatocyten van de gastheer. PbGFP 11 wordt gebruikt in combinatie met transgene hepatocyten (Hepa1-6-achtergrond) die residuen tot expressie brengen die het GFP 1-10-fragment (GFP 1-10) in het cytoplasma vormen (Hepa GFP 1-10-cellen). PbGFP11 rapporteert PV-lysis in de hepatocyten van de gastheer door zelfcomplementatie en de hervorming van functioneel GFP en het groene fluorescentiesignaal18. Merk op dat GFP 11 is gecodeerd als een reeks van zeven tandemsequenties in PbGFP11 om het resulterende fluorescentiesignaal te versterken. Bij het kleuren van PbGFP11 sporozoïeten met de cytoplasmatische kleurstof CellTrace Violet (CTV), kunnen we de parasieten volgen. De lysis van dergelijke CTV-gekleurde intracellulaire parasieten zelf resulteert in lekkage van CTV in het cytoplasma van de gastheercel en kleuring van de gastheercel. Naast het visualiseren en onderscheiden van de lysis van Plasmodium PV en/of de parasiet in gastheerhepatocyten, kan dit systeem op betrouwbare wijze worden gebruikt om de immuunroutes te bestuderen die verantwoordelijk zijn voor een van deze processen, door de genetische of therapeutische verstoring van de moleculaire componenten van dergelijke routes.

Protocol

Al het onderzoek met gewervelde dieren in ons laboratorium werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en protocollen voor diergebruik van de Universiteit van Georgia. 1. Generatie van P. berghei-geïnfecteerde muizen Start een infectie in het bloedstadium bij mannelijke of vrouwelijke, 6-8 weken oude C57BL/6 (B6)-muizen met behulp van wildtype P. berghei-parasieten. Om dit te doen, brengt u gecryopreserveerd P. berghei-geïnfecteerd<…

Representative Results

Het bepalen van de frequentie en ontwikkeling van schizonten is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat voldoende levensvatbare parasieten zich in het optimale stadium voor transfectie bevinden. Onrijpe schizonten kunnen worden onderscheiden van volledig volwassen schizonten door de aanwezigheid van minder merozoïeten die niet de hele intracellulaire ruimte van de RBC vullen (Figuur 1B). Het is belangrijk op te merken dat bij het maken van bloeduitstrijkjes uit gekweekt bloed, geïnfect…

Discussion

We hebben het bovenstaande protocol in ons laboratorium gebruikt om verschillende lijnen van transgene P. berghei-parasieten te maken. Hoewel geoptimaliseerd voor P. berghei, hebben we dit protocol ook met succes gebruikt om transgene P. yoelii-sporozoïeten te genereren. Na het injecteren van de getransfecteerde schizonten in muizen, zijn parasieten meestal niet later dan 3 d.p.i. detecteerbaar in alle groepen, inclusief de controle zonder plasmide. De selectie wordt pas gestart nadat parasite…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie AI168307 aan SPK.  We danken de UGA CTEGD Flow Cytometry Core en de UGA CTEGD Microscopy Core. We erkennen ook de bijdragen van Ash Pathak, Anne Elliot en het personeel van UGA Sporocore bij het optimaliseren van het protocol. We willen Dr. Daichi Kamiyama bedanken voor waardevolle inzichten, discussie en de ouderplasmiden die GFP11 en GFP 1-10 bevatten. We willen ook de leden van het Kurup-lab bedanken voor hun constante steun, geduld en aanmoediging.

Materials

30 G x 1/2" Syringe needle Exel international 26437
Alsever's solution Sigma-Aldritch A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 Lonza VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) TCI America T1420
Blood collection tubes BD bioscience 365967 for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer INCYTO DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish Greiner Bio-One 627860
Centrifuge 5425 Eppendorf 5405000107
Centrifuge 5910R Eppendorf 5910R For gradient centrifugation
Delta Vision II – Inverted microscope system Olympus IX-71
Dimethyl Sulfoxide Sigma D5879-500ml
Fetal bovine serum GenClone 25-525
GFP11 plasmid Kurup Lab pSKspGFP11 Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain Sigma-Aldritch 48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells Kurup Lab Hepa GFP1-10 Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum Used for mosquito dissection media
NaCl Millipore-Sigma SX0420-5 1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II Amaxa Biosystems (Lonza) Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette VWR 14673-043
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldritch P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium) Cytivia 17-0891-02 Details in protocol
PL0017 Plasmid BEI Resources MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration) Sigma 46706 Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
SoftWoRx microscopy software Applied Precision v6.1.3

References

  1. WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
  3. Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
  4. Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
  5. Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
  6. Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
  7. Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
  8. Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
  9. Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
  10. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
  11. Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
  12. Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
  13. Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
  14. Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
  15. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
  16. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
  17. Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
  18. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  19. Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
  20. Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
  21. de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
  22. Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
  23. Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
  24. Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
  25. Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).

Play Video

Cite This Article
Bowers, C., Kurup, S. P. Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites. J. Vis. Exp. (195), e64992, doi:10.3791/64992 (2023).

View Video