Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei
Summary
La malaria si trasmette attraverso l’inoculazione dello stadio sporozoite di Plasmodium da parte di zanzare infette. Il Plasmodium transgenico ci ha permesso di comprendere meglio la biologia della malaria e ha contribuito direttamente agli sforzi di sviluppo del vaccino contro la malaria. In questo articolo descriviamo una metodologia semplificata per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei .
Abstract
La malaria è una malattia mortale causata dal parassita Plasmodium e si trasmette attraverso la puntura delle zanzare femmine di zanzara Anopheles . Lo stadio sporozooitico di Plasmodium depositato dalle zanzare nella pelle degli ospiti vertebrati subisce una fase di sviluppo obbligatorio nel fegato prima di iniziare la malaria clinica. Sappiamo poco sulla biologia dello sviluppo del Plasmodium nel fegato; l’accesso allo stadio di sporozoite e la capacità di modificare geneticamente tali sporozoiti sono strumenti fondamentali per studiare la natura dell’infezione da Plasmodium e la conseguente risposta immunitaria nel fegato. Qui presentiamo un protocollo completo per la generazione di sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei . Modifichiamo geneticamente P. berghei allo stadio sanguigno e usiamo questa forma per infettare le zanzare Anopheles quando assumono un pasto di sangue. Dopo che i parassiti transgenici si sono sviluppati nelle zanzare, isoliamo lo stadio di sporozoite del parassita dalle ghiandole salivari della zanzara per la sperimentazione in vivo e in vitro . Dimostriamo la validità del protocollo generando sporozoiti di un nuovo ceppo di P. berghei che esprime la subunità 11 della proteina fluorescente verde (GFP) (GFP11) e mostriamo come potrebbe essere utilizzato per studiare la biologia della malaria allo stadio epatico.
Introduction
Nonostante i progressi nello sviluppo di farmaci e nella ricerca sulla prevenzione e il trattamento della malaria, il carico globale di malattia della malaria rimane elevato. Oltre mezzo milione di persone muoiono di malaria ogni anno, con i più alti livelli di mortalità osservati tra i bambini che vivono in regioni endemiche per la malaria, comel’Africa sub-sahariana. La malaria è causata dal parassita Plasmodium, che viene trasmesso all’uomo attraverso la puntura di zanzare Anopheles femmine che portano il parassita nelle loro ghiandole salivari. Lo stadio infettivo del Plasmodium, gli sporozoiti, si deposita nella pelle dei vertebrati ospiti durante un pasto di sangue e viaggia attraverso il flusso sanguigno per infettare le cellule del fegato, dove subiscono uno sviluppo obbligatorio (costituendo la malaria pre-eritrocitica) prima di infettare gli eritrociti. L’infezione degli eritrociti dà inizio allo stadio ematico della malaria ed è responsabile della totalità della morbilità e della mortalità associate alla malattia 2,3.
La natura obbligata dello sviluppo pre-eritrocitario del Plasmodium lo ha reso un bersaglio attraente per gli sforzi di profilassi di vaccini e farmaci4. Un prerequisito per studiare la biologia della malaria pre-eritrocitica, così come lo sviluppo di vaccini o farmaci mirati allo stadio epatico, è l’accesso agli sporozoiti di Plasmodium. Inoltre, la nostra capacità di generare sporozoiti di Plasmodium geneticamente modificati è stata determinante per il successo di tali sforzi di ricerca 5,6,7,8,9. Linee transgeniche di Plasmodium che esprimono proteine reporter fluorescenti o luminescenti ci hanno permesso di seguirne lo sviluppo in vivo e in vitro10,11. I parassiti geneticamente attenuati (GAP), generati attraverso la delezione di più geni nel Plasmodium, sono anche alcuni dei candidati vaccini più promettenti12,13.
I modelli di malaria di roditori e primati non umani ci hanno aiutato a comprendere i meccanismi delle interazioni ospite-parassita nella malaria umana a causa delle somiglianze nella biologia e nel ciclo vitale tra le specie di Plasmodium 14. L’uso di specie di Plasmodium che infettano i roditori, ma non gli esseri umani (ad esempio, P. berghei) consente il mantenimento dell’intero ciclo di vita del parassita e la generazione di sporozoiti infettivi per lo studio della malaria allo stadio epatico in un ambiente controllato di livello 1 di biosicurezza. Esiste già una varietà di protocolli separati per la generazione di parassiti transgenici del Plasmodium 15, l’infezione delle zanzare16 e l’isolamento degli sporozoiti17. In questo articolo, delineiamo un protocollo completo che combina queste metodologie al fine di generare e isolare sporozoiti transgenici di P. berghei, utilizzando il nuovo ceppo transgenico PbGFP11 come esempio. PbGFP 11 traffica l’undicesimo filamento β della proteina fluorescente verde (GFP), GFP11, nel vacuolo parassitoforo (PV) generato negli epatociti ospiti. PbGFP 11 è usato in combinazione con epatociti transgenici (Hepa1-6 background) che esprimono residui che costituiscono il frammento GFP 1-10 (GFP 1-10) nel citoplasma (cellule Hepa GFP 1-10). PbGFP11 riporta la lisi PV negli epatociti ospiti attraverso l’auto-complementazione e la riformazione della GFP funzionale e il segnale di fluorescenza verde18. Da notare che GFP 11 è codificato come una serie di sette sequenze tandem in PbGFP11 per migliorare il segnale di fluorescenza risultante. Dopo aver colorato gli sporozoiti PbGFP11 con il colorante citoplasmatico CellTrace Violet (CTV), possiamo rintracciare i parassiti. La lisi di tali parassiti intracellulari colorati con CTV provoca di per sé la fuoriuscita di CTV nel citoplasma della cellula ospite e la colorazione della cellula ospite. Oltre a visualizzare e distinguere la lisi di Plasmodium PV e/o del parassita negli epatociti dell’ospite, questo sistema può essere utilizzato in modo affidabile per studiare le vie immunitarie responsabili di uno di questi processi, attraverso la perturbazione genetica o terapeutica delle componenti molecolari di tali vie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo utilizzato il protocollo di cui sopra nel nostro laboratorio per creare diverse linee di parassiti transgenici P. berghei. Sebbene ottimizzato per P. berghei, abbiamo anche utilizzato con successo questo protocollo per generare sporozoiti transgenici di P. yoelii. Dopo aver iniettato gli schizonti trasfettati nei topi, i parassiti sono rilevabili in genere non più tardi di 3 d.p.i. in tutti i gruppi, compreso il controllo senza plasmidi. La selezione viene avviata solo una volta che la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Institutes of Health AI168307 a SPK. Ringraziamo il nucleo di citometria a flusso UGA CTEGD e il nucleo di microscopia UGA CTEGD. Riconosciamo anche i contributi di Ash Pathak, Anne Elliot e dello staff di UGA Sporocore nell’ottimizzazione del protocollo. Vogliamo ringraziare il Dr. Daichi Kamiyama per le preziose intuizioni, la discussione e i plasmidi genitori contenenti GFP11 e GFP 1-10. Vorremmo anche ringraziare i membri del laboratorio Kurup per il loro costante supporto, pazienza e incoraggiamento.
Materials
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II – Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
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