Summary

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

이 프로토콜은 hiPSC를 안구 클러스터로 분화하고 부착 및 현탁 배양 시스템을 모두 포함하는 단순화된 배양 조건을 사용하여 신경-망막 오가노이드를 생성하는 효율적인 방법을 설명합니다. RPE 및 각막 상피와 같은 다른 안구 세포 유형도 망막 배양의 성숙한 안구에서 분리할 수 있습니다.

Abstract

만능 줄기 세포는 체외 질병 모델링 연구 및 재생 요법 개발에 유용한 복잡한 조직 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 망막 분화의 처음 4주 동안 뚜렷하고 자가 조직화된 안구 필드 원시 클러스터(EFP)가 출현할 때까지 부착성 단층 배양으로 구성된 하이브리드 배양 시스템에서 망막 오가노이드를 생성하는 더 간단하고 강력하며 단계적인 방법을 설명합니다. 또한, 각 EFP 내의 도넛 모양, 원형 및 반투명 신경-망막 섬을 수동으로 채취하여 망막 분화 배지에서 1-2주 동안 비부착성 배양 접시를 사용하여 현탁액 하에서 배양하여 다층 3D 광학 컵(OC-1M)을 생성합니다. 이 미성숙 망막 오가노이드는 PAX6+ 및 ChX10+ 증식, 다능성 망막 전구체를 함유하고 있습니다. 전구체 세포는 오가노이드 내에서 선형적으로 자가 조립되며 뚜렷한 방사형 줄무늬로 나타납니다. 현탁 배양 후 4주에 망막 전구체는 유사분열 후 정지 및 계통 분화를 거쳐 성숙한 망막 오가노이드(OC-2M)를 형성합니다. 광수용체 계통 커밋된 전구체는 망막 오가노이드의 가장 바깥쪽 층 내에서 발생합니다. 이러한 CRX+ 및 RCVRN+ 광수용체 세포는 형태학적으로 성숙하여 내부 세그먼트와 같은 확장을 표시합니다. 이 방법은 인간 배아 줄기 세포(hESC)와 유도만능 줄기 세포(iPSC)를 사용하여 망막 오가노이드를 생성하는 데 채택할 수 있습니다. 모든 단계와 절차는 복제 가능성을 보장하고 기초 과학 및 중개 연구에서 더 넓은 응용 분야를 위해 명확하게 설명되고 시연됩니다.

Introduction

망막은 척추동물의 눈 뒤쪽에 존재하는 빛에 민감한 조직으로, 광전달 경로로 알려진 생화학적 현상에 의해 빛 신호를 신경 자극으로 변환합니다. 망막의 광수용체 세포에서 생성된 초기 신경 자극은 다른 망막 중간 뉴런과 망막 신경절 세포(RGC)로 변환되어 뇌의 시각 피질에 도달하여 이미지 인식 및 시각 반응을 돕습니다.

세계보건기구(WHO)에 따르면 약 150만 명의 어린이가 맹인이며 그 중 100만 명이 아시아에 있습니다. 유전성 망막 이영양증(Inherited Retinal Dystrophy, IRD)은 전 세계 인구 4,000명 중 1명에게 영향을 미치는 주요 실명 질환이며1,2,3, 개발도상국에서는 연령 관련 황반변성(AMD)과 관련된 실명 유병률이 0.6%-1.1%에 이른다4. IRD는 망막 발달 및 기능에 관여하는 300개 이상의 서로 다른 유전자의 유전적 결함에 의해 발생한다5. 이러한 유전적 변화는 정상적인 망막 기능의 파괴와 망막 세포, 즉 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE)의 점진적인 퇴행을 초래하여 심각한 시력 상실 및 실명을 초래합니다. 각막, 수정체 등과 관련된 다른 실명 상태에서 엄청난 진전이 이루어졌습니다. 그러나 망막 이영양증과 시신경 위축은 현재까지 입증된 치료법이 없습니다. 성체 인간 망막에는 줄기세포가 없기 때문에6, 배아줄기세포(ESC)와 환자 유래 유도만능줄기세포(iPSC)와 같은 대체 공급원은 원하는 세포 유형을 무제한으로 공급할 수 있으며, 체외 질환 모델링 연구 및 재생 요법 개발에 필요한 복잡한 조직 오가노이드 개발에 큰 가능성을 지니고 있다7. 8,9,10.

수년간의 망막 연구를 통해 초기 망막 발달을 조율하는 분자 사건에 대한 더 나은 이해가 이루어졌습니다. PSC에서 망막 세포와 3D 오가노이드를 생성하는 대부분의 프로토콜은 알려진 생물학적 과정을 단계적으로 조절하기 위해 성장 인자와 소분자의 복잡한 칵테일에서 세포를 배양함으로써 시험관 내에서 이러한 발달 사건을 요약하는 것을 목표로 합니다. 이렇게 생성된 망막 오가노이드는 망막 신경절 세포(RGC), 중간 뉴런, 광수용체 및 망막 색소 상피(RPE)와 같은 주요 망막 세포로 구성됩니다.11,12,13,14,15,16,17,18,19. 망막 오가노이드를 사용하여 IRD를 모델링하려는 성공적인 시도에도 불구하고, 분화 중 성장 인자와 소분자의 복잡한 칵테일에 대한 요구 사항과 망막 오가노이드 생성의 상대적으로 낮은 효율은 대부분의 프로토콜에서 주요 과제를 제기합니다. 그들은 주로 배아체의 형성을 포함하고, 시험관 내 발달의 여러 단계에서 복잡한 배양 조건을 사용하여 망막 계통으로의 단계적 분화를 포함합니다20,21,22.

여기에서는 건강한 대조군 및 망막 질환 특이적 hiPSC에서 복잡한 3D 신경-망막 오가노이드를 개발하는 간단하고 강력한 방법이 보고되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 배아체 형성 없이 거의 합류에 가까운 hiPSC 배양의 직접적인 분화를 활용합니다. 또한 배양 배지의 복잡성이 단순화되어 새로운 연구자들이 쉽게 채택할 수 있는 비용 효율적이고 재현 가능한 기술입니다. 여기에는 망막 분화의 처음 4주 동안 뚜렷하고 자기 조직화된 안구 필드 원시 클러스터(EFP)가 출현할 때까지 부착성 단층 배양으로 구성된 하이브리드 배양 시스템이 포함됩니다. 또한, 각 EFP 내의 원형 신경-망막 섬을 수동으로 채취하여 1-2주 동안 현탁 배양에서 성장시켜 PAX6+ 및 CHX10+ 증식 신경-망막 전구체로 구성된 다층 3D 망막 컵 또는 오가노이드를 준비합니다. 100μM 타우린 함유 배지에서 추가로 4주 동안 망막 오가노이드를 장기간 배양한 결과 RCVRN+ 및 CRX+ 광수용체 전구체와 기본적인 내부 세그먼트 유사 확장을 가진 성숙 세포가 출현했습니다.

Protocol

hiPSC와 관련된 모든 실험은 표준 실험실 관행, 윤리 및 생물 안전 지침을 준수하고 기관 윤리 위원회(IEC), 줄기 세포 연구를 위한 기관 위원회(IC-SCR) 및 기관 생물 안전 위원회(IBSC)와 같은 규제 기관의 승인을 받아 무균적으로 수행되었습니다. 1. iPSC 배양액과 망막 분화 배지 및 시약의 제조 iPSC 배양 및 유지 배지배양 및 정상 hiPSC 라인23</…

Representative Results

hiPSC를 눈 계통으로 분화하는 것은 그림 1에 설명된 바와 같이 보충제와 성장 인자를 포함하는 다양한 배양 배지에서 세포를 서로 다른 시점에서 순차적인 단계로 배양함으로써 달성됩니다. 상기 hiPSC 배양물은 만능줄기세포 유지 배지인 Essential 8 배지에서 유지된다. 70%-80% 밀도에 도달하면(그림 2A), 배지는 0일(3.2단계 참조)에 1ng/mL bFGF, 1ng/mL Noggin 및 1% N…

Discussion

hiPSC는 시험관 내에서 장기 및 조직 발달을 연구하는 강력한 도구입니다. 건강한 hiPSC와 질병 특이적 hiPSC를 망막 계통으로 구별하여 질병 표현형을 요약하면 다양한 형태의 유전성 망막 이영양증의 병태생리학에 대한 새로운 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. PSC를 망막 세포 유형으로의 시험관 내 분화를 위해 여러 프로토콜이 설명되고 채택되었습니다. 대부분은 N1, N2 및 B27 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 유전학자인 Dr. Chitra Kannabiran의 과학적, 기술적 지원을 인정합니다. Subhadra Jalali 박사, 망막 컨설턴트; Milind Naik 박사, 안과 성형 외과 의사; 하이데라바드에 있는 LV Prasad Eye Institute의 안과 종양 전문의인 Dr. Swathi Kaliki는 정상 및 환자 맞춤형 iPSC 라인 생성을 위해 노력하고 있습니다. 저자는 과학 및 공학 연구위원회, 과학 기술부 (IM), (SB / SO / HS / 177 / 2013), 생명 공학부 (IM), (BT / PR32404 / MED / 30 / 2136 / 2019) 및 ICMR (S.M., D.P.), UGC (TA) 및 CSIR (V.K.P.), 인도 정부의 선임 연구원.

Materials

0.22 µm Syringe filters TPP 99722 
15 mL centrifuge tube TPP 91015
50 mL centrifuge tube TPP 91050
6 well plates TPP 92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal Santa Cruz SC365519 1:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal Abcam ab140603 1:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal Abcam ab3201 1:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal      Millipore AB5585 1:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher 17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF) Sigma Aldrich F0291
Centrifuge 5810R Eppendorf
Coplin Jar (50 mL) Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 354277
CryoTubes Thermo Fisher V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) Thermo Fisher 10565-018
DreamTaq DNA polymerase Thermo Fisher EP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 14190144
Essential 8 medium kit Thermo Fisher A1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma Aldrich E5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm  Corning 351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States  Gibco 26140079
GelDocXR+ with Image lab software BIO-RAD Agarose Gel documentation system 
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 1:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 Invitrogen A11030 1:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 Invitrogen A11035 1:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1:300 dilution
HistoCore MULTICUT Leica For sectioning
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
L-Acsorbic acid Sigma Aldrich A92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher 11140-050
N2 supplement (100x) Thermo Fisher 17502048
NanoDrop 2000 Thermo Fisher To quantify RNA
Paraformaldehyde Qualigens 23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged Corning 7095D-9
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher 15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal Abcam ab183951 1:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal Abcam ab195045 1:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal Abcam ab231782 1:300 dilution
Recombinant Human Noggin Protein R&D Systems 6057-NG
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Serological pipettes 10 mL TPP 94010
Serological pipettes 5 mL TPP 94005
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641
Starfrost (silane coated) microscopic slides Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Invitrogen 18080051
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI  Vector laboratories H-1200 
Vitronectin Thermo Fisher A27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) Sigma Aldrich Y0503
Zeiss LSM 880 Zeiss Confocal microscope

References

  1. Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
  4. Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
  5. . RetNet – Retinal Information Network Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022)
  6. Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
  7. Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
  8. Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
  9. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
  10. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  11. Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
  12. Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  15. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  16. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  17. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  18. Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
  19. Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
  20. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  21. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  22. Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
  23. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Play Video

Cite This Article
Mahato, S., Agrawal, T., Pidishetty, D., Maddileti, S., Pulimamidi, V. K., Mariappan, I. Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (190), e64509, doi:10.3791/64509 (2022).

View Video