健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

網膜は脊椎動物の目の後ろに存在する光感受性組織であり、光伝達経路として知られる生化学的現象によって光信号を神経インパルスに変換します。網膜の視細胞で生成された最初の神経インパルスは、他の網膜介在ニューロンと網膜神経節細胞(RGC)に形質導入され、脳の視覚野に到達し、画像知覚と視覚反応に役立ちます。

世界保健機関(WHO)によると、推定150万人の子供が失明しており、そのうち100万人がアジアにいます。遺伝性網膜ジストロフィー(IRD)は、世界中の4,000人に1人が罹患する主要な失明性疾患ですが^1,2,3、加齢黄斑変性症(AMD)に関連する失明の有病率は、発展途上国では0.6%〜^1.1%の範囲です⁴。IRDは、網膜の発生と機能に関与する300以上の異なる遺伝子の遺伝性遺伝的欠陥によって引き起こされ^ます5。このような遺伝的変化は、正常な網膜機能の破壊と網膜細胞、すなわち光受容体細胞と網膜色素上皮(RPE)の段階的な変性をもたらし、したがって重度の視力喪失と失明につながります。角膜、水晶体などを含む他の失明状態では大きな進歩が見られました。しかし、網膜ジストロフィーと視神経萎縮症は、これまでに証明された治療法を持っていません。成人のヒト網膜には幹細胞がないため⁶、胚性幹細胞(ESC)や患者由来の人工多能性幹細胞(iPSC)などの代替ソースは、目的の細胞タイプを無制限に供給でき、in vitro疾患モデリング研究や再生療法の開発に必要な複雑な組織オルガノイドの開発に大きな期待を寄せています^7。8,9,10。

数年の網膜研究により、初期の網膜発生を調整する分子イベントの理解が深まりました。PSCから網膜細胞と3Dオルガノイドを生成するためのほとんどのプロトコルは、成長因子と低分子の複雑なカクテルで細胞を培養して既知の生物学的プロセスを段階的に調節することにより、これらの発生イベントをin vitroで再現することを目的としています。このようにして生成された網膜オルガノイドは、主要な網膜細胞、すなわち網膜神経節細胞(RGC)、介在ニューロン、光受容体、および網膜色素性上皮(RPE)で構成されています11,12,13,14,15,16,17,18,19.網膜オルガノイドを用いたIRDのモデリングは成功しているが、分化中の成長因子と低分子の複雑なカクテルの必要性と網膜オルガノイド生成の比較的低い効率は、ほとんどのプロトコルで大きな課題となっている。それらは主に胚様体の形成とそれに続くin vitro発生の異なる段階での複雑な培養条件を使用した網膜系統への段階的な分化を含む^20,21,22。

ここでは、健常対照および網膜疾患特異的なhiPS細胞から複雑な3D神経-網膜オルガノイドを開発するための簡単で堅牢な方法が報告されています。ここで説明するプロトコルは、胚様体形成を必要とせずに、ほぼコンフルエントなhiPS細胞培養物の直接分化を利用します。また、培地の複雑さが簡素化され、新しい研究者が簡単に採用できる費用対効果と再現性の高い技術になります。これには、網膜分化の最初の4週間から明確な自己組織化された眼野原始クラスター(EFP)の出現までの付着性単層培養からなるハイブリッド培養システムが含まれます。さらに、各EFP内の円形の神経網膜島を手動でピックし、浮遊培養で1〜2週間増殖させて、PAX6⁺およびCHX10⁺増殖神経網膜前駆体からなる多層3D網膜カップまたはオルガノイドを調製します。100 μMタウリン含有培地中での網膜オルガノイドをさらに4週間延長培養すると、RCVRN+およびCRX⁺光受容体前駆体と、初歩的な内部セグメントのような伸長を有する成熟細胞が出現しました。