Este protocolo descreve um método eficiente de diferenciar hiPSCs em clusters de campos oculares e gerar organoides neuro-retinianos usando condições de cultura simplificadas envolvendo sistemas de cultura aderentes e de suspensão. Outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano, também podem ser isolados de campos oculares maduros em culturas de retina.
Células-tronco pluripotentes podem gerar organoides teciduais complexos que são úteis para estudos de modelagem de doenças in vitro e para o desenvolvimento de terapias regenerativas. Este protocolo descreve um método mais simples, robusto e gradual de geração de organoides da retina em um sistema híbrido de cultura consistindo de culturas aderentes de monocamadas durante as primeiras 4 semanas de diferenciação retiniana até o surgimento de grupos primordiais de campo ocular (PFEs) distintos e auto-organizados. Além disso, as ilhas neurorretinianas em forma de rosca, circulares e translúcidas dentro de cada EFP são manualmente colhidas e cultivadas sob suspensão usando placas de cultura não aderentes em um meio de diferenciação retiniana por 1-2 semanas para gerar copos ópticos 3D multicamadas (OC-1M). Estes organoides imaturos da retina contêm precursores multipotentes da retina com proliferação de PAX6+ e ChX10+. As células precursoras são linearmente auto-organizadas dentro dos organoides e aparecem como estrias radiais distintas. Após 4 semanas da cultura de suspensão, os progenitores da retina sofrem parada pós-mitótica e diferenciação de linhagens para formar organoides retinianos maduros (OC-2M). Os precursores comprometidos da linhagem fotorreceptora desenvolvem-se dentro das camadas mais externas dos organoides da retina. Essas células fotorreceptoras CRX+ e RCVRN+ amadurecem morfologicamente para exibir extensões segmentares internas. Este método pode ser adotado para a geração de organoides da retina usando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Todas as etapas e procedimentos são claramente explicados e demonstrados para garantir a replicabilidade e para aplicações mais amplas em ciência básica e pesquisa translacional.
A retina é um tecido sensível à luz presente na parte de trás do olho do vertebrado que converte sinais luminosos em impulsos nervosos por um fenômeno bioquímico conhecido como via de fototransdução. Os impulsos nervosos iniciais gerados nas células fotorreceptoras da retina são transduzidos para outros interneurônios da retina e células ganglionares da retina (RGCs) e atingem o córtex visual do cérebro, o que ajuda na percepção da imagem e na resposta visual.
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que 1,5 milhão de crianças sejam cegas, das quais 1 milhão estão na Ásia. A distrofia hereditária da retina (DIR) é uma importante doença cegante que afeta 1 em cada 4.000 indivíduos em todo o mundo 1,2,3, enquanto a prevalência de cegueira associada à degeneração macular relacionada à idade (DMRI) varia de 0,6%-1,1% em países emdesenvolvimento4. Os IRDs são causados por defeitos genéticos hereditários em mais de 300 genes diferentes envolvidos no desenvolvimento e função da retina5. Tais alterações genéticas resultam na interrupção das funções normais da retina e na degeneração gradual das células da retina, nomeadamente as células fotorreceptoras e o epitélio pigmentado da retina (EPR), levando assim a uma grave perda de visão e cegueira. Enormes progressos foram feitos em outras condições de cegamento envolvendo a córnea, lente, etc. No entanto, distrofias retinianas e atrofias do nervo óptico não têm nenhuma terapia comprovada até o momento. Uma vez que a retina humana adulta não possui células-tronco6, fontes alternativas como células-tronco embrionárias (CTEs) e células-tronco pluripotentes induzidas derivadas do paciente (iPSCs) podem fornecer um suprimento ilimitado de tipos celulares desejados e ser uma grande promessa para o desenvolvimento de organoides teciduais complexos necessários para estudos de modelagem de doenças in vitro e para o desenvolvimento de terapias regenerativas7, 8,9,10.
Vários anos de pesquisa na retina levaram a uma melhor compreensão dos eventos moleculares que orquestram o desenvolvimento inicial da retina. A maioria dos protocolos para gerar células da retina e organoides 3D a partir de PSCs visa recapitular esses eventos de desenvolvimento in vitro, cultivando as células em um complexo coquetel de fatores de crescimento e pequenas moléculas para modular os processos biológicos conhecidos de forma escalonada. Os organoides da retina assim gerados são constituídos pelas principais células da retina: células ganglionares da retina (CGRs), interneurônios, fotorreceptores e epitélio pigmentado da retina (EPR)11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Apesar das tentativas bem-sucedidas de modelar IRDs usando organoides da retina, a exigência do complexo coquetel de fatores de crescimento e pequenas moléculas durante a diferenciação e a eficiência relativamente baixa da geração de organoides da retina representam um grande desafio com a maioria dos protocolos. Incluem principalmente a formação de corpos embrionários, seguida de sua diferenciação gradual em linhagens retinianas utilizando condições complexas de cultura em diferentes estágios de desenvolvimento in vitro 20,21,22.
Aqui, um método simplificado e robusto de desenvolvimento de organoides neuro-retinianos 3D complexos a partir de controle saudável e hiPSCs específicas da doença da retina é relatado. O protocolo aqui descrito utiliza a diferenciação direta de culturas de hiPSC quase confluentes sem a necessidade de formação de corpo embrionário. Além disso, a complexidade do meio de cultura é simplificada, tornando-o uma técnica custo-efetiva e reprodutível que pode ser facilmente adotada por novos pesquisadores. Envolve um sistema híbrido de cultura que consiste em culturas aderentes de monocamadas durante as primeiras 4 semanas de diferenciação retiniana até o surgimento de grupos primordiais de campos oculares (PFEs) distintos e auto-organizados. Além disso, as ilhas neuro-retinianas circulares dentro de cada EFP são colhidas manualmente e cultivadas em culturas de suspensão por 1-2 semanas para preparar copos de retina 3D multicamadas ou organoides consistindo de precursores neuro-retinais de proliferação PAX6+ e CHX10+. A cultura prolongada de organoides da retina em meio contendo taurina 100 μM por mais 4 semanas resultou no surgimento de precursores fotorreceptores RCVRN+ e CRX+ e células maduras com extensões rudimentares semelhantes a segmentos internos.
hiPSCs são uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento de órgãos e tecidos in vitro. Recapitular o fenótipo da doença diferenciando hiPSCs saudáveis versus doença-específicas em direção à linhagem retiniana pode ajudar a obter novos conhecimentos sobre a fisiopatologia de diferentes formas de distrofias hereditárias da retina. Vários protocolos têm sido descritos e adotados para a diferenciação in vitro de CTPs em tipos celulares da retina. A maioria deles envolve o uso de mei…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem o apoio científico e técnico do Dr. Chitra Kannabiran, Geneticista; Dra. Subhadra Jalali, Consultora de Retina; Dr. Milind Naik, Cirurgião Oculoplástico; e o Dr. Swathi Kaliki, oncologista ocular do LV Prasad Eye Institute, Hyderabad, para a geração de linhas iPSC normais e específicas do paciente. Os autores agradecem as bolsas de P&&D do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia, Departamento de Ciência e Tecnologia (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Departamento de Biotecnologia (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) e Bolsas de Pesquisa Sênior do ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) e CSIR (V.K.P.), Governo da Índia.
0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |