Het huidige protocol beschrijft een procedure voor het isoleren van darmen van volwassen Caenorhabditis elegans nematodewormen met de hand voor input in genomica, proteomica, microbioom of andere testen.
De Caenorhabditis elegans darm bestaat uit slechts 20 cellen en is de nexus van vele levensondersteunende functies, waaronder spijsvertering, metabolisme, veroudering, immuniteit en omgevingsrespons. Kritische interacties tussen de C. elegans-gastheer en zijn omgeving komen samen in de darm, waar de darmmicrobiota zich concentreren. Daarom is het vermogen om darmweefsel te isoleren weg van de rest van de worm noodzakelijk om darmspecifieke processen te beoordelen. Dit protocol beschrijft een methode voor het met de hand ontleden van volwassen C. elegans darmen. De procedure kan worden uitgevoerd in fluorescerend gelabelde stammen voor gemak of trainingsdoeleinden. Zodra de techniek is geperfectioneerd, kunnen darmen worden verzameld van niet-gelabelde wormen van elk genotype. Deze microdissectiebenadering maakt het mogelijk om tegelijkertijd darmweefsel en darmmicrobiota van de gastheer te vangen, een voordeel voor veel microbioomstudies. Als zodanig kunnen downstream-toepassingen voor de darmpreparaten die door dit protocol worden gegenereerd, RNA-isolatie van darmcellen en DNA-isolatie van gevangen microbiota omvatten, maar zijn ze niet beperkt tot. Over het algemeen biedt handdissectie van C. elegans-darmen een eenvoudige en robuuste methode om kritieke aspecten van de darmbiologie te onderzoeken.
De Caenorhabditis elegans nematodeworm, met slechts 959 cellen en een levenscyclus van 4 dagen, is een ideaal modelsysteem voor veel genetica, genomica en ontwikkelingsstudies 1,2. Het gemak van voorwaartse en omgekeerde genetische screening, de prevalentie van gemanipuleerde fluorescerende markers, het vermogen om nucleotide-specifieke genoombewerking uit te voeren en de vele gemeenschapsbrede bronnen hebben allemaal bijgedragen aan belangrijke ontdekkingen en inzichten in het C. elegans-systeem. Een belangrijk nadeel is echter de moeilijkheid om zuivere populaties van cellen, weefsels of organen te verkrijgen, die klein, fragiel en onderling verbonden kunnen zijn. Omdat zuivere populaties van cellen belangrijk zijn voor genomics-assays zoals RNA-seq, ChIP-seq en ATAC-seq, zijn er verschillende benaderingen ontstaan om pure preparaten van C. elegans-cellen, weefsels en organen te verkrijgen. Hier wordt een methode beschreven voor het met de hand ontleden van darmen, in grote delen, van volwassen C. elegans-wormen. De resulterende preparaten zijn geschikt voor downstream genomics assays (figuur 1).
De hier beschreven fijnmazige weefseldissectiemethode (figuur 2) is slechts één benadering. Andere alternatieve technieken – zoals moleculaire tagging, het uitsplitsen van wormen en het zuiveren van celtypen van belang met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en post hoc analyse – zijn ook met succes gebruikt om de weefselspecifieke kenmerken van C. elegans moleculaire biologie te onderzoeken. Een voordeel van handdissectie ten opzichte van deze andere benaderingen is echter dat het kan worden gebruikt om tegelijkertijd de kenmerken van de C. elegans-darm en zijn bacteriële inhoudte onderzoeken 3,4,5. Dit maakt 16S rRNA-gensequencing mogelijk en vergemakkelijkt microbioomstudies binnen het C. elegans-systeem. Een belangrijke beperking is echter dat darmcellen niet individueel geïsoleerd worden.
Moleculaire tagging verleent een celtypespecifieke tag alleen aan moleculen binnen het opgegeven weefsel of de cellen van belang. Deze tags kunnen vervolgens worden geïsoleerd uit totale wormpreparaten. Op deze manier hebben weefselspecifieke promotors die een gelabeld polyA-bindend eiwit of gesplitste leider aansturen, weefselspecifieke transcriptoomprofilering 6,7,8,9,10 en 3’UTR mapping11,12 mogelijk gemaakt. Evenzo zijn weefselspecifieke transcriptiefactorprofielen uitgevoerd met behulp van ChIP-seq en DamID, waarbij promotorspecifieke transcriptiefactorvarianten werden toegevoegd met tags of enzymfusies13,14.
FACS maakt het mogelijk om celtypen van belang te isoleren van gedissocieerde wormen op basis van hun intrinsieke cellulaire kenmerken en fluorescerende eigenschappen. Deze benadering heeft weefselspecifieke transcriptomen gegenereerd uit diverse organen 8,15,16 en individuele neuronale celtypen 8,9,15,16,17,18 en is gebruikt om een expressiekaart van het gehele C. elegans zenuwstelsel te maken19,20 . FACS, en zijn neef fluorescentie-geactiveerde kernensortering (FANS), zijn ook gebruikt om celspecifieke chromatineprofielen21,22 te genereren.
Ten slotte kan post-hoc analyse worden uitgevoerd in single-cell resolution assays. Bij deze methode worden alle individuele cellen onderzocht, het celtype van elk wordt toegewezen in de analysefase en de celtypen van belang worden selectief gefilterd voor verder onderzoek. Post-hoc analyse is met succes gebruikt om transcriptomen te verkrijgen van zich ontwikkelende cellen met zowel hoge ruimtelijke als temporele resolutie in C. elegans embryo’s 23,24,25,26,27 en L1 28 stadium wormen. Chromatine toegankelijkheid is ook gekarakteriseerd met behulp van ATAC-seq in plaats van RNA-seq met behulp van een vergelijkbare strategie29.
Elke aanpak heeft zijn voor- en nadelen. Voor de C. elegans darm is wormdisaggregatie en FACS-isolatie van darmcellen haalbaar in de embryo- en larvale stadia30, maar is een uitdaging bij volwassenen. Dit wordt verondersteld te wijten te zijn aan de grote, endo-reduplicated en sterk aanhankelijke cellen van de darm waardoor ze moeilijk onbeschadigd te dissociëren zijn. De hier beschreven handdissectiemethode omzeilt deze uitdagingen, waardoor grote delen van de darm van de volwassen worm kunnen worden geïsoleerd. De praktijk van het met de hand ontleden van geslachtsklieren uit ditzelfde stadium is wijdverspreid en eenvoudig. Darmdissectie is vergelijkbaar met gonadedissectie, maar wordt minder vaak uitgevoerd32. Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op een langer, ongepubliceerd protocol ontwikkeld door Dr. James McGhee en Barb Goszczynski. Dit gestroomlijnde protocol leent technieken voor het isoleren van blastomeren uit embryo’s in een vroeg stadium 23,33,34,35. Hoewel handdissectie niet haalbaar is voor het isoleren van de meeste cel- of weefseltypen in C. elegans, is het ideaal voor het isoleren van darmen van volwassen wormen. Daarom is handdissectie een aanvulling op andere middelen voor het verkrijgen van darmspecifieke celpreparaten.
Dit artikel beschrijft het stapsgewijze protocol voor het met de hand ontleden van darmen van volwassen C. elegans, waarbij zuivere preparaten voor stroomafwaartse testen worden gegenereerd. Kritieke stappen in dit protocol zijn (1) ervoor zorgen dat de wormen niet te veel worden verlamd, (2) nauwkeurige dissectiesneden maken, (3) micropipetetten van de juiste grootte smeden voor dissectie en (4) zorgen voor het snelle herstel van gezonde darmen tijdens de uiteindelijke oogst. Om deze redenen moet voorzichtig worden omgegaan met het blootstellen van wormen aan de levamisoloplossing en moeten de hypodermische naalden regelmatig worden vernieuwd om maximale scherpte te garanderen. Het hanteren van de darm met behulp van de microcapillaire pipet en mondaspirator is een andere stap die oefening zal vergen. Goed gesmede micropipetten van de juiste grootte maken ook een aanzienlijk verschil bij het isoleren van grote delen van de darm tijdens dissecties, naast het verminderen van het risico op het verliezen van darmen in de micropipet. Nieuwe protocolgebruikers verliezen vaak darmen aan de binnenrand van de microcapillaire pipet voordat ze in het isolatiereagens kunnen worden uitgeworpen. Dit probleem kan worden gewijzigd met oefening en goed gesmede microcapillaire pipetten.
Het hierin beschreven protocol is ontworpen voor gebruik bij volwassen wormen. Voorlopige proeven ondersteunen dat dit protocol ook effectief is voor gebruik bij L4-wormen en oudere volwassen wormen. De werkzaamheid van dit protocol is echter nog niet geëvalueerd bij wormen in het vroege larvale stadium. Een beperking van deze aanpak is de kleine hoeveelheid materiaal die het oplevert. Hoewel de hoeveelheden voldoende zijn voor RNA-seq en PCR, zijn ze mogelijk niet geschikt voor andere testen. Als zodanig moeten gebruikers bepalen of de minimaal vereiste input voor een test haalbaar kan worden verzameld met dit protocol.
Ons laboratorium maakt routinematig gebruik van FACS om darmcellen te zuiveren na isolatie30, post-hoc analysemethoden voor darmcelidentificatie en deze handdissectiemethode30,42. Handdissectie heeft het voordeel dat het vatbaar is voor gebruik bij volwassen wormen wanneer wormdisaggregatie en celisolatie minder succesvol zijn. Bovendien zijn de efficiëntie en kwaliteit van totaal RNA geëxtraheerd uit handdissectiepreparaten hoog, waarschijnlijk omdat de weefsels snel uit de wormen worden geplukt en vervolgens snel worden afgezet in een nucleïnezuurisolatiereagens, waardoor de afbraak van RNA wordt verminderd. Een ander voordeel van de handdissectiemethode is dat het goedkoop is, gemakkelijk te leren en geen gespecialiseerde apparatuur vereist. Ten slotte maakt deze aanpak de oogst en isolatie van darmbacteriën uit wormdarmen mogelijk, waardoor downstream microbioomstudies mogelijk worden.
Het hier beschreven handdissectieprotocol voor het isoleren van darmen van volwassen C. elegans vormt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van verschillende aspecten van de biologie van C. elegans . Met een pure voorbereiding van darmen kunnen onderzoekers bijvoorbeeld de kruising tussen immuniteit, veroudering, metabolisme en het microbioom onderzoeken.
The authors have nothing to disclose.
We zijn dank verschuldigd aan het pionierswerk van James McGhee en Barb Goszczynski, die in eerste instantie de darmdissectiemethode ontwikkelden waaruit dit protocol is aangepast. Ons werk wordt ondersteund door een MIRA (R35) Award onder toezicht van het National Institute of General Medical Sciences (National Institutes of Health, R35GM124877 aan EON) en een NSF-CAREER Award onder toezicht van de NSF MCB Div Of Molecular and Cellular Bioscience (Award #2143849 aan EON).
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-420 | Nuclease free BSA |
CL2122 worm strain | CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | CL2122 | dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT. |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher | C79 | needed for making Egg Salts |
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-108 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-103 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
Concavity slide (2-well) | Electron Microscopy Sciences | 71878-08 | 12-pk of 2-well concavity slides |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Millipore Sigma | E3889 | needed for making chelation buffer |
Fluorescent Dissection Microscope | Leica | M205 FCA | This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections |
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Millipore Sigma | H4034 | needed for making dissection buffer |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | for assesment of total RNA quality and quantity |
HostZERO Microbial DNA Kit | Zymo Research | D4310 | Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms |
Hypodermic Needle (27G x 1/2") | BD Scientific | 305109 | needed for hand dissection of intestines |
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) | Millipore Sigma | L9756 | used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines. |
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) | BD Scientific | 309628 | Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger. |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher | M33 | needed for making Egg Salts |
Magnesium Sulfate Hpetahydrate | Sigma-Aldrich | 230391-500G | needed for making M9 buffer |
MF-900 Microforge | Narishige | MF-900 | Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research. |
1.7 mL Microtubes, Clear | Olympus Plastics | 22-282 | Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage. |
Mouth Aspirator Tube | Millipore Sigma | A5177 | Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines. |
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay | Thermo Fisher | A50137 | Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR. |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging. |
Petri Dish (35 x 10 mm) | Genesee Scientific – Olympus Plastics | 32-103 | Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection. |
Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9730 | Used in the isolation of total RNA |
Potassium Chloride | Millipore Sigma | 529552 | needed for making Egg Salts |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500G | needed for making M9 buffer |
Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
Qubit RNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32852 | Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol. |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms |
Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection |
Sodium Chloride | Fisher | S271 | needed for making Egg Salts |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | needed for making M9 buffer |
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) | Thermo Fisher | 72302520 | Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting. |
4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity |
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix | Applied Biosystems | A52699 | master mix used for qPCR |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred. |
Worm Pick | NA | NA | Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details. |