本协议描述了一种手动从 秀丽隐杆线 虫成虫中分离肠道的程序,以输入基因组学、蛋白质组学、微生物组或其他测定。
秀丽隐杆线虫肠道仅由20个细胞组成,是许多生命支持功能的纽带,包括消化,新陈代谢,衰老,免疫和环境反应。秀丽隐杆线虫宿主与其环境之间的关键相互作用在肠道内汇聚,肠道微生物群集中在那里。因此,将肠道组织与蠕虫的其余部分隔离开来的能力对于评估肠道特异性过程是必要的。该协议描述了一种手工解剖成年秀丽隐杆线虫肠道的方法。该程序可以在荧光标记的菌株中进行,以便于或训练目的。一旦技术完善,就可以从任何基因型的未标记蠕虫中收集肠道。这种显微切割方法允许同时捕获宿主肠道组织和肠道微生物群,这对许多微生物组研究都有好处。因此,该方案产生的肠道制剂的下游应用可以包括但不限于从肠细胞中分离RNA和从捕获的微生物群中分离DNA。总体而言,秀丽隐杆线虫肠道的手解剖提供了一种简单而强大的方法来研究肠道生物学的关键方面。
秀丽隐杆线虫线虫只有 959 个细胞和 4 天的卵到卵生命周期,是许多遗传学、基因组学和发育研究的理想模型系统1,2。正向和反向遗传筛选的便利性、工程荧光标记的流行、进行核苷酸特异性基因组编辑的能力以及众多社区范围内的资源都有助于秀丽隐杆线虫系统的重大发现和见解。然而,一个显着的缺点是难以获得纯粹的细胞,组织或器官群体,这些细胞,组织或器官很小,脆弱并且可以相互连接。由于纯细胞群对于基因组学测定(如RNA-seq,ChIP-seq和ATAC-seq)很重要,因此已经出现了几种方法来获得秀丽隐杆线虫细胞,组织和器官的纯制剂。这里描述了一种从秀丽隐杆线虫成虫中大切片手工解剖肠道的方法。所得制剂适用于下游基因组学测定(图1)。
这里描述的精细组织解剖方法(图2)只是一种方法。其他替代技术 – 例如分子标记,解聚蠕虫以及通过荧光激活细胞分选(FACS)和事后分析纯化感兴趣的细胞类型 – 也已成功用于研究秀丽隐杆线虫分子生物学的组织特异性特征。然而,与其他方法相比,手部解剖的一个优点是,它可以用来同时探索秀丽隐杆线虫肠道的特征及其细菌含量3,4,5。这使得16S rRNA基因测序成为可能,并促进秀丽隐杆线虫系统内的微生物组研究。然而,一个重要的限制是肠细胞不是单独分离的。
分子标记仅将细胞类型特异性标记赋予指定组织或目标细胞内的分子。然后可以将这些标签与整个蠕虫制剂分离。通过这种方式,驱动标记的polyA结合蛋白或剪接领导者的组织特异性启动子已经实现了组织特异性转录组分析6,7,8,9,10和3’UTR映射11,12。类似地,使用ChIP-seq和DamID进行了组织特异性转录因子谱,其中启动子特异性转录因子变体附加了标签或酶融合13,14。
FACS允许根据其固有的细胞特征和荧光特性从解离的蠕虫中分离感兴趣的细胞类型。这种方法已经从不同的器官8,15,16和单个神经元细胞类型8,9,15,16,17,18中产生了组织特异性转录组,并已用于创建整个秀丽隐杆线虫神经系统的表达图19,20.FACS及其表亲荧光激活细胞核分选(FANS)也已用于生成细胞特异性染色质谱21,22。
最后,可以在单细胞分辨率测定中进行事后分析。在该方法中,调查所有单个细胞,在分析阶段归因每个细胞的细胞类型,并选择性地过滤感兴趣的细胞类型以进行进一步研究。事后分析已成功用于获得秀丽隐杆线虫胚胎 23、24、25、26、27 和 L1 28 期蠕虫中具有高空间和时间分辨率的发育细胞的转录组。染色质可及性也使用ATAC-seq而不是RNA-seq使用类似的策略表征29。
每种方法都有其优点和局限性。对于秀丽隐杆线虫肠道,蠕虫分解和肠道细胞的FACS分离在胚胎和幼虫阶段30中是可以实现的,但在成虫中具有挑战性。这被认为是由于肠道的大细胞、内在重复和强贴壁细胞使它们难以解离而不受损伤。这里描述的手部解剖方法规避了这些挑战,允许分离成虫肠道的大部分。从同一阶段手工解剖性腺的做法是广泛而直接的。肠道清扫术与性腺清扫术相似,但较少进行32。这里介绍的协议改编自James McGhee博士和Barb Goszczynski开发的更长的,未发表的协议。这种简化的方案借用了从早期胚胎中分离卵裂球的技术23,33,34,35。虽然手部解剖对于分离秀丽隐杆线虫中的大多数细胞或组织类型是不可行的,但它是分离肠道和成虫的理想选择。因此,手解剖补充了获得肠道特异性细胞制剂的其他方法。
本文介绍了从 秀丽隐杆线虫成年中手工解剖肠道的分步方案,为下游测定生成纯制剂。该方案中的关键步骤包括(1)确保不会过度麻痹蠕虫,(2)进行准确的解剖切割,(3)锻造适当尺寸的微量移液器进行解剖,以及(4)确保在最终收获期间快速恢复健康肠道。由于这些原因,将蠕虫暴露于左旋咪唑溶液时必须小心,并且需要经常刷新皮下注射针头以确保最大清晰度。使用微毛细管移液器和口腔吸引器处理肠道是另一个需要练习的步骤。适当尺寸的锻造微量移液器除了降低微量移液器内肠道丢失的风险外,还可以在解剖过程中分离大部分肠道方面产生重大影响。新方案使用者通常会在微毛细管移液管内边缘丢失肠道,然后才能将其喷射到分离试剂中。这个问题可以通过实践和正确锻造的微毛细管移液器来修正。
本文描述的方案设计用于成虫。初步试验支持该方案对L4蠕虫和老年蠕虫也有效。然而,该方案的有效性尚未在早期幼虫阶段蠕虫中进行评估。这种方法的局限性是它产生的材料量小。虽然这些数量对于RNA-seq和PCR是足够的,但它们可能不足以用于其他测定。因此,用户需要确定是否可以使用此协议切实收集测定所需的最小输入。
我们的实验室常规使用FACS纯化分离后的肠细胞30,肠细胞鉴定的事后分析方法,以及这种手解剖方法30,42。手部解剖的优点是,当蠕虫分解和细胞分离不太成功时,适合用于成虫。此外,从手部解剖制剂中提取的总RNA的效率和质量很高,这可能是因为组织从蠕虫中快速取出,然后快速沉积在核酸分离试剂中,从而减少了RNA降解。手撕法的另一个好处是成本低,易于学习,并且不需要专门的设备。最后,这种方法允许从蠕虫肠道中收获和分离肠道细菌,从而实现下游微生物组研究。
这里描述的用于从 成年秀丽隐杆 线虫中分离肠道的手解剖方案代表了研究 秀丽隐杆线虫 生物学各个方面的有力工具。例如,通过纯肠道制剂,研究人员可以研究免疫、衰老、新陈代谢和微生物组之间的交集。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢James McGhee和Barb Goszczynski的开创性工作,他们最初开发了肠道解剖方法,该方法适用于此协议。我们的工作得到了由美国国家普通医学科学研究所(美国国立卫生研究院,R35GM124877至EON)监督的MIRA(R35)奖和由NSF MCB Div of Molecular and Cellular Bioscience监督的NSF-CAREER奖(EON奖#2143849)的支持。
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-420 | Nuclease free BSA |
CL2122 worm strain | CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | CL2122 | dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT. |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher | C79 | needed for making Egg Salts |
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-108 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-103 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
Concavity slide (2-well) | Electron Microscopy Sciences | 71878-08 | 12-pk of 2-well concavity slides |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Millipore Sigma | E3889 | needed for making chelation buffer |
Fluorescent Dissection Microscope | Leica | M205 FCA | This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections |
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Millipore Sigma | H4034 | needed for making dissection buffer |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | for assesment of total RNA quality and quantity |
HostZERO Microbial DNA Kit | Zymo Research | D4310 | Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms |
Hypodermic Needle (27G x 1/2") | BD Scientific | 305109 | needed for hand dissection of intestines |
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) | Millipore Sigma | L9756 | used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines. |
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) | BD Scientific | 309628 | Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger. |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher | M33 | needed for making Egg Salts |
Magnesium Sulfate Hpetahydrate | Sigma-Aldrich | 230391-500G | needed for making M9 buffer |
MF-900 Microforge | Narishige | MF-900 | Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research. |
1.7 mL Microtubes, Clear | Olympus Plastics | 22-282 | Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage. |
Mouth Aspirator Tube | Millipore Sigma | A5177 | Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines. |
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay | Thermo Fisher | A50137 | Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR. |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging. |
Petri Dish (35 x 10 mm) | Genesee Scientific – Olympus Plastics | 32-103 | Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection. |
Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9730 | Used in the isolation of total RNA |
Potassium Chloride | Millipore Sigma | 529552 | needed for making Egg Salts |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500G | needed for making M9 buffer |
Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
Qubit RNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32852 | Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol. |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms |
Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection |
Sodium Chloride | Fisher | S271 | needed for making Egg Salts |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | needed for making M9 buffer |
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) | Thermo Fisher | 72302520 | Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting. |
4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity |
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix | Applied Biosystems | A52699 | master mix used for qPCR |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred. |
Worm Pick | NA | NA | Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details. |