Summary

Un método de limpieza de tejidos para imágenes neuronales de escalas mesoscópicas a microscópicas

Published: May 10, 2022
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Summary

El protocolo proporciona un método detallado de imágenes neuronales en cortes cerebrales utilizando un método de limpieza de tejidos, ScaleSF. El protocolo incluye la preparación del tejido cerebral, la clarificación del tejido, el manejo de rodajas despejadas y la microscopía de escaneo láser confocal de las estructuras neuronales desde los niveles mesoscópicos hasta los microscópicos.

Abstract

Aquí se proporciona un protocolo detallado para visualizar las estructuras neuronales desde los niveles mesoscópicos hasta los microscópicos en los tejidos cerebrales. Las estructuras neuronales que van desde los circuitos neuronales hasta las estructuras neuronales subcelulares se visualizan en rodajas cerebrales de ratón limpiadas ópticamente con ScaleSF. Este método de limpieza es una versión modificada de ScaleS y es un método de limpieza de tejido hidrófilo para rodajas de tejido que logra una potente capacidad de limpieza, así como un alto nivel de preservación de las señales de fluorescencia y la integridad estructural. Una cámara de imágenes tridimensional (3D) personalizable está diseñada para un montaje confiable de tejidos cerebrales despejados. Los cerebros de ratón inyectados con un vector de virus adenoasociado que transportaba un gen de proteína fluorescente verde mejorado se fijaron con paraformaldehído al 4% y se cortaron en rodajas de 1 mm de espesor con una cortadora de tejido vibrante. Las rebanadas cerebrales se eliminaron siguiendo el protocolo de limpieza, que incluye incubaciones secuenciales en tres soluciones, a saber, solución ScaleS0, solución salina tampón de fosfato (–) y solución ScaleS4, para un total de 10.5-14.5 h. Las rodajas cerebrales despejadas se montaron en la cámara de imágenes y se incrustaron en gel de agarosa al 1,5% disuelto en la solución ScaleS4D25 (0). La adquisición de imágenes 3D de las rodajas se llevó a cabo utilizando un microscopio de barrido láser confocal equipado con una lente de objetivo de inmersión múltiple de una larga distancia de trabajo. Comenzando con imágenes neuronales mesoscópicas, logramos visualizar estructuras neuronales subcelulares finas, como espinas dendríticas y boutons axonales, en las rebanadas cerebrales ópticamente despejadas. Este protocolo facilitaría la comprensión de las estructuras neuronales desde el circuito hasta las escalas de componentes subcelulares.

Introduction

Los métodos de limpieza de tejidos han mejorado la obtención de imágenes independientes de la profundidad de muestras biológicas y clínicas con microscopía de luz, lo que permite extraer información estructural sobre tejidos intactos 1,2. Las técnicas de limpieza óptica también podrían acelerar y reducir el costo del análisis histológico. Actualmente, hay tres enfoques principales de limpieza disponibles: métodos hidrófilos, hidrófobos y basados en hidrogel 1,2. Los enfoques hidrófilos superan en la preservación de las señales de fluorescencia y la integridad de los tejidos y son menos tóxicos en comparación con los otros dos enfoques 3,4.

Un método de limpieza hidrofílica, ScaleS, ocupa una posición distintiva con su preservación de la integridad estructural y molecular, así como una potente capacidad de limpieza (espectro de limpieza-preservación)5. En un estudio anterior, desarrollamos un protocolo de limpieza rápido e isométrico, ScaleSF, para rodajas de tejido (~ 1 mm de espesor) modificando el procedimiento de limpieza de ScaleS6. Este protocolo de limpieza requiere incubaciones secuenciales de cortes cerebrales en tres soluciones durante 10.5-14.5 h. El método se presenta con un alto espectro de limpieza y preservación, que es compatible incluso con el análisis de microscopía electrónica (EM) (Figura suplementaria 1), lo que permite obtener imágenes tridimensionales (3D) de alta resolución a múltiples escalas con reconstrucción precisa de la señal6. Por lo tanto, ScaleSF debe ser eficaz especialmente en el cerebro, donde las células neuronales elaboran procesos exuberantes de tremenda longitud, y organizan estructuras subcelulares finas especializadas para transmitir y recibir información. La extracción de información estructural con escalas desde el circuito hasta los niveles subcelulares en las células neuronales es bastante útil para una mejor comprensión de las funciones cerebrales.

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para visualizar estructuras neuronales con escalas desde el nivel mesoscópico / circuito hasta el nivel microscópico / subcelular utilizando ScaleSF. El protocolo incluye la preparación de tejidos, la clarificación de tejidos, el manejo de tejidos despejados y la microscopía de barrido láser confocal (CLSM) de tejidos despejados. Nuestro protocolo se centra en interrogar estructuras neuronales desde el circuito hasta las escalas de componentes subcelulares. Para obtener un procedimiento detallado para la preparación de las soluciones y la inyección estereotáxica de vectores de virus adenoasociados (AAV) en cerebros de ratón, consulte Miyawaki et al. 20167 y Okamoto et al. 20218, respectivamente.

Protocol

Todos los experimentos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Juntendo (Aprobación No. 2021245, 2021246) y realizados de acuerdo con las Directrices Fundamentales para la Conducta Adecuada de Experimentos con Animales por el Consejo científico de Japón (2006). Aquí, se utilizaron ratones machos C57BL/6J inyectados con vector AAV portador del gen de proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) y ratones transgénicos de parvalbúmina (PV)/miristoilación-EGF…

Representative Results

La limpieza óptica de una rebanada de cerebro de ratón de 1 mm de espesor se logró utilizando este protocolo. La Figura 1B representa imágenes de transmisión de una rebanada de cerebro de ratón antes y después del tratamiento de limpieza. El método de limpieza de tejido hizo que una rebanada de cerebro de ratón de 1 mm de grosor fuera transparente. Se encontró una ligera expansión en los tamaños finales de las rebanadas cerebrales después de la incubación en la solución de limpieza durante…

Discussion

Pasos críticos dentro del protocolo
Hay algunos pasos críticos en el protocolo que deben llevarse a cabo con la máxima precaución para obtener resultados significativos. La fijación uniforme de muestras es imprescindible para la obtención de imágenes 3D dentro de tejidos a gran escala. La lente del objetivo, la muestra y el fluido de inmersión deben tener ri correspondiente. El desajuste de RI entre ellos conducirá a imágenes altamente perturbadas de las células que expresan EGFP dentro de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Yoko Ishida (Universidad de Juntendo) por la producción de vectores AAV y a Kisara Hoshino (Universidad de Juntendo) por la asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por JSPS KAKENHI (JP20K07231 a K.Y.; JP21H03529 a T.F.; JP20K07743 a M.K.; JP21H02592 a S.S.) e Investigación Científica en el Área Innovadora “Resonancia Bio” (JP18H04743 a H.H.). Este estudio también fue apoyado por la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (AMED) (JP21dm0207112 a T.F. y H.H.), Moonshot R&D de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST) (JPMJMS2024 a H.H.), Investigación Orientada a la Fusión para Ciencia y Tecnología disruptiva (FOREST) de JST (JPMJFR204D a H.H.), Becas en Ayuda del Instituto de Investigación para Enfermedades de la Vejez en la Facultad de Medicina de la Universidad de Juntendo (X2016 a K.Y.; X2001 a H.H.), y el Private School Branding Project.

Materials

16x multi-immersion objective lens Leica Microsystems HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar Nacalai Tesque 01028-85
Agarose TaKaRa Bio L03
Dimethyl sulfoxide Nacalai Tesque 13407-45
D-Sorbitol Nacalai Tesque 06286-55
γ-cyclodextrin Wako Pure Chemical Industries 037-10643
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Huygens Essential Scientific Volume Imaging ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris Bitplane ver. 9.0.0
Leica Application Suite X Leica Microsystems LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin Tokyo Chemical Industry M1356
Paraformaldehyde Merck Millipore 1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) Nacalai Tesque 27575-31 10x PBS(–)
Sodium azide Nacalai Tesque 31233-55
Sodium pentobarbital Kyoritsu Seiyaku N/A
TCS SP8 Leica Microsystems N/A
Triton X-100 Nacalai Tesque 35501-15
Urea Nacalai Tesque 35940-65
Vibrating tissue slicer Dosaka EM PRO7N

References

  1. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  3. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  4. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  5. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  6. Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
  7. Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
  8. Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
  9. Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
  10. Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
  11. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  12. Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
  13. Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).
  14. Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
  15. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  16. Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
  17. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).

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Cite This Article
Yamauchi, K., Okamoto, S., Takahashi, M., Koike, M., Furuta, T., Hioki, H. A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales. J. Vis. Exp. (183), e63941, doi:10.3791/63941 (2022).

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