Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas
Summary
O protocolo fornece um método detalhado de imagem neuronal na fatia cerebral usando um método de limpeza tecidual, ScaleSF. O protocolo inclui preparação de tecidos cerebrais, esclarecimento de tecidos, manuseio de fatias limpas e microscopia de varredura a laser confocal de estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos.
Abstract
Um protocolo detalhado é fornecido aqui para visualizar estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos em tecidos cerebrais. Estruturas neuronais que vão desde circuitos neurais até estruturas neuronais subcelulares são visualizadas em fatias cerebrais de camundongos adequadamente limpas com ScaleSF. Este método de compensação é uma versão modificada do ScaleS e é um método de limpeza de tecido hidrofílico para fatias teciduais que alcança potente capacidade de limpeza, bem como um alto nível de preservação de sinais de fluorescência e integridade estrutural. Uma câmara de imagem digital 3D digitalizado (3D) personalizável é projetada para uma montagem confiável de tecidos cerebrais limpos. Cérebros de camundongos injetados com um vetor de vírus associado ao adeno carregando um gene de proteína fluorescente verde aprimorado foram corrigidos com 4% de paraformaldeído e cortados em fatias de espessura de 1 mm com um cortador de tecido vibrante. As fatias cerebrais foram limpas seguindo o protocolo de compensação, que incluem incubações sequenciais em três soluções: solução ScaleS0, soro fisco tampão de fosfato (–), e solução ScaleS4, totalizando 10,5-14,5 h. As fatias cerebrais limpas foram montadas na câmara de imagem e embutidas em gel de 1,5% de agarose dissolvido na solução ScaleS4D25(0). A aquisição de imagem 3D das fatias foi realizada utilizando um microscópio de varredura a laser confocal equipado com uma lente objetiva de multi-imersão de uma longa distância de trabalho. Começando com imagens neuronais mesoscópicas, conseguimos visualizar estruturas neuronais subcelulares finas, como espinhas dendríticas e boutons axonais, nas fatias cerebrais adequadamente limpas. Este protocolo facilitaria a compreensão das estruturas neuronais desde circuito até escalas de componentes subcelulares.
Introduction
Os métodos de limpeza tecidual melhoraram a imagem independente de profundidade de amostras biológicas e clínicas com microscopia leve, permitindo a extração de informações estruturais em tecidos intactos 1,2. Técnicas de compensação óptica também poderiam potencialmente acelerar e reduzir o custo para análise histológica. Atualmente, três grandes abordagens de compensação estão disponíveis: métodos à base de hidrofílico, hidrofóbico e hidrogel 1,2. As abordagens hidrofílicas superam na preservação de sinais de fluorescência e integridade tecidual e são menos tóxicas em comparação com as outras duas abordagens 3,4.
Um método de compensação hidrofílica, ScaleS, mantém uma posição distinta com sua preservação da integridade estrutural e molecular, bem como potente capacidade de compensação (espectro de preservação de desmatamento)5. Em um estudo anterior, desenvolvemos um protocolo de compensação rápida e isométrica, ScaleSF, para fatias de tecido (~1 mm de espessura) modificando o procedimento de compensação do ScaleS6. Este protocolo de compensação requer incubações sequenciais de fatias cerebrais em três soluções para 10,5-14,5 h. O método é apresentado com um espectro de alta preservação de compensação, que é compatível mesmo com a análise de microscopia eletrônica (EM) (Figura Suplementar 1), permitindo imagens tridimensionais (3D) de alta resolução em larga escala com reconstrução precisa do sinal6. Assim, o ScaleSF deve ser eficaz especialmente no cérebro, onde as células neuronais elaboram processos exuberantes de comprimento tremendo, e organizam estruturas subcelulares finas especializadas para transmitir e receber informações. Extrair informações estruturais com escalas de circuito para níveis subcelulares em células neuronais é bastante útil para uma melhor compreensão das funções cerebrais.
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para visualizar estruturas neuronais com escamas do mesoscópico/circuito ao nível microscópico/subcelular usando ScaleSF. O protocolo inclui preparação tecidual, esclarecimento de tecidos, manuseio de tecidos limpos e microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM) de tecidos limpos. Nosso protocolo se concentra em interrogar estruturas neuronais de circuito para escalas de componentes subcelulares. Para um procedimento detalhado para a preparação das soluções e injeção estereotaxica de vetores de vírus associados ao adeno (AAV) em cérebros de camundongos, consulte Miyawaki et al. 20167 e Okamoto et al. 20218, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos dentro do protocolo
Existem alguns passos críticos no protocolo que devem ser conduzidos com a máxima cautela para obter resultados significativos. A fixação uniforme das amostras é imprescindível para imagens 3D dentro de tecidos de grande escala. A lente objetiva, a amostra e o fluido de imersão devem ter ri correspondente. A incompatibilidade de RI entre eles levará a imagens altamente perturbadas de células expressas por EGFP dentro das fatias cerebrais limpas (Fi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Yoko Ishida (Universidade de Juntendo) pela produção de vetores AAV e kisara Hoshino (Universidade de Juntendo) pela assistência técnica. Este estudo foi apoiado por JSPS KAKENHI (JP20K07231 a K.Y.; JP21H03529 a T.F.; JP20K07743 a M.K.; JP21H02592 a H.H.) e Pesquisa Científica sobre Área Inovadora “Ressonância Bio” (JP18H04743 a H.H.). Este estudo também foi apoiado pela Agência japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED) (JP21dm0207112 a T.F. e H.H.), Moonshot P&D da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão (JST) (JPMJMS2024 a H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) da JST (JPMJFR204D a H.H.), Grants-in-Aid do Instituto de Pesquisa para Doenças da Velhice na Escola de Medicina da Universidade de Juntendo (X2016 a K.Y.; X2001 para H.H.), e o Projeto de Branding de Escolas Particulares.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
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