التصوير الكمي 3D للخلايا المصابة بداء المثقبيات ، و amastigotes النائمة ، والخلايا التائية في الأعضاء المصفاة السليمة
Summary
ويصف هذا البروتوكول الفحص المجهري الفلوري الخفيف والأساليب الآلية بمساعدة البرمجيات لتصور طفيليات المثقبيات والخلايا التائية المنتشرة والنائمة في الأعضاء والأنسجة السليمة والواضحة وتحديدها كميا بدقة. توفر هذه التقنيات طريقة موثوقة لتقييم نتائج العلاج وتقديم رؤى جديدة حول التفاعلات بين الطفيليات والمضيف.
Abstract
مرض شاغاس هو مرض مهمل يؤثر على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم ، وخاصة في أمريكا اللاتينية. عامل مرض شاغاس ، Trypanosoma cruzi (T. cruzi) ، هو طفيلي ملزم داخل الخلايا مع بيولوجيا متنوعة تصيب العديد من أنواع الثدييات ، بما في ذلك البشر ، مما يسبب أمراض القلب والجهاز الهضمي. لطالما كانت هناك حاجة إلى الكشف الموثوق به عن عدوى T. cruzi في الجسم الحي لفهم البيولوجيا المعقدة لمرض شاغاس وتقييم نتائج أنظمة العلاج بدقة. يوضح البروتوكول الحالي خط أنابيب متكامل للقياس الكمي الآلي للخلايا المصابة ب T. cruzi في الأعضاء المعاد بناؤها وتطهيرها بتقنية 3D. يسمح الفحص المجهري الفلوري ذو الألواح الضوئية بتصور دقيق وتحديد كمي لطفيليات T. cruzi المنتشرة والنائمة بنشاط والخلايا المستجيبة المناعية في الأعضاء أو الأنسجة بأكملها. أيضا ، تم اعتماد خط أنابيب CUBIC-HistoVision للحصول على علامات موحدة للأعضاء التي تم تطهيرها بالأجسام المضادة والبقع النووية بنجاح. يوفر تطهير الأنسجة إلى جانب التلطيخ المناعي 3D نهجا غير متحيز لتقييم بروتوكولات العلاج الدوائي بشكل شامل ، وتحسين فهم التنظيم الخلوي للأنسجة المصابة ب T. cruzi ، ومن المتوقع أن يعزز الاكتشافات المتعلقة بالاستجابات المناعية المضادة ل T. cruzi ، وتلف الأنسجة ، والإصلاح في مرض شاغاس.
Introduction
يعد مرض شاغاس ، الذي يسببه الطفيلي الأولي T. cruzi ، من بين أكثر الأمراض المدارية إهمالا في العالم ، مما يتسبب في حوالي 13000 حالة وفاة سنوية. غالبا ما تتطور العدوى من مرحلة حادة إلى مرحلة مزمنة تنتج أمراض القلب في 30٪ من المرضى ، بما في ذلك عدم انتظام ضربات القلب وفشل القلب والموت المفاجئ 1,2. على الرغم من الاستجابة المناعية القوية للمضيف التي أثيرت ضد الطفيلي خلال المرحلة الحادة ، إلا أن أعدادا منخفضة من الطفيليات تستمر بشكل مزمن طوال حياة المضيف في أنسجة مثل القلب والعضلات الهيكلية. قد تساهم عدة عوامل ، بما في ذلك تأخر ظهور الاستجابات المناعية التكيفية ووجود أشكال غير متكررة من الطفيلي ، في قدرة T. cruzi على تجنب القضاء التام من قبل الجهاز المناعي3،4،5،6. علاوة على ذلك ، فإن الأشكال النائمة غير المكررة للطفيلي تظهر قابلية منخفضة للعقاقير المثقبسية وقد تكون مسؤولة جزئيا عن فشل العلاج الذي لوحظ في كثير من الحالات 7,8.
يوفر تطوير تقنيات تصوير جديدة فرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على التوزيع المكاني للطفيليات في الأنسجة المصابة وعلاقتها بالخلايا المناعية المشاركة في السيطرة عليها. هذه الخصائص حاسمة لفهم أفضل لعمليات السيطرة على الطفيليات من قبل الجهاز المناعي وتتبع الطفيليات النائمة النادرة الموجودة في الأنسجة المزمنة.
يعد الفحص المجهري الفلوري ذو الألواح الضوئية (LSFM) أحد أكثر الطرق شمولا وغير متحيزة للتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة أو الأعضاء الكبيرة دون تقسيم رقيق. تستخدم المجاهر ذات الألواح الضوئية صفيحة رقيقة من الضوء لإثارة الفلوروفورات فقط في المستوى البؤري ، وتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية للعينات ، وتسجيل صور لآلاف طبقات الأنسجة باستخدام كاميرات فائقة السرعة. يتم الحصول على المستوى العالي من شفافية الأنسجة اللازمة للاختراق السليم لضوء الليزر في الأنسجة عن طريق تجانس معامل الانكسار (RI) بعد إزالة الدهون من الأنسجة وإزالة اللون ، مما يقلل من تشتت الضوء ويجعل الصور عالية الجودة9،10،11.
تم تطوير أساليب تطهير الأنسجة لتصوير الفئران الكاملة 12،13،14 ، والمواد العضوية 15،16،17 ، والأعضاء التي تعبر عن علامات الفلورسنت المراسلة18،19،20،21،22،23 ، ومؤخرا عدد محدود من الأنسجة البشرية 24 . تصنف الطرق الحالية لإزالة الأنسجة إلى ثلاث عائلات: (1) الطرق القائمة على المذيبات العضوية مثل بروتوكولات DISCO 25,26 ، (2) الطرق القائمة على الهيدروجيل ، مثل CLARITY27 ، والطرق المائية ، مثل CUBIC (كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الواضحة وغير المعيقة والتحليل الحسابي) 18,19,28,29 . تحافظ بروتوكولات CUBIC على شكل العضو وسلامة الأنسجة ، مع الحفاظ على تألق البروتينات المراسلة الداخلية المعبر عنها. يسمح آخر تحديث لهذه التقنية ، CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV) ، أيضا بالكشف عن الظواهر باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت ووضع علامات الحمض النووي28.
في هذا البروتوكول ، تم استخدام خط أنابيب CUBIC للكشف عن T. cruzi الذي يعبر عن البروتينات الفلورية في أنسجة الفئران السليمة الواضحة. تم تصوير الأنسجة الشفافة بصريا LSFM ، وإعادة بناء 3D ، وتم تحديد العدد الإجمالي الدقيق للخلايا المصابة ب T. cruzi ، و amastigotes النائمة ، والخلايا التائية لكل عضو تلقائيا. أيضا ، تم اعتماد هذا البروتوكول بنجاح للحصول على علامات موحدة للأعضاء التي تم تطهيرها مع الأجسام المضادة والبقع النووية. هذه النهج ضرورية لفهم توسع ومكافحة T. cruzi في المضيفين المصابين وهي مفيدة للتقييم الكامل للعلاجات الكيميائية والمناعية لمرض شاغاس.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن غياب التصوير الشامل للأعضاء الكاملة للطفيليات والاستجابة المناعية يحد من فهم تعقيد التفاعلات بين الطفيليات المضيفة ويعوق تقييم علاجات مرض شاغاس. اعتمدت هذه الدراسة خط أنابيب CUBIC لتوضيح وتلطيخ الأعضاء والأنسجة السليمة للفئران المصابة ب T. cruzi.
تم اختبار بروتوكولات إ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور إيتسو سوساكي على مساعدته القيمة وتوصياته فيما يتعلق ببروتوكولات تطهير الأنسجة والتلطيخ المناعي. أيضا ، نحن ممتنون ل M. Kandasamy من CTEGD Biomedical Microscopy Core على الدعم الفني باستخدام LSFM والتصوير البؤري. كما نشكر جميع أعضاء مجموعة تارلتون للأبحاث على اقتراحاتهم المفيدة طوال هذه الدراسة.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
