Количественная 3D-визуализация клеток, инфицированных Trypanosoma cruzi, спящих амастиготов и Т-клеток в интактных осветленных органах
Summary
Настоящий протокол описывает флуоресцентную микроскопию и автоматизированные программные методы визуализации и точной количественной оценки размножающихся и спящих паразитов Trypanosoma cruzi и Т-клеток в неповрежденных, очищенных органах и тканях. Эти методы обеспечивают надежный способ оценки результатов лечения и предлагают новое понимание взаимодействия паразита и хозяина.
Abstract
Болезнь Шагаса является забытой патологией, которая поражает миллионы людей во всем мире, в основном в Латинской Америке. Возбудитель болезни Шагаса, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), является облигатным внутриклеточным паразитом с разнообразной биологией, который заражает несколько видов млекопитающих, включая человека, вызывая сердечные и пищеварительные патологии. Надежное выявление инфекций T. cruzi in vivo уже давно необходимо для понимания сложной биологии болезни Шагаса и точной оценки результатов схем лечения. Текущий протокол демонстрирует интегрированный конвейер для автоматизированной количественной оценки клеток, инфицированных T. cruzi, в 3D-реконструированных, очищенных органах. Флуоресцентная микроскопия позволяет точно визуализировать и количественно оценивать активно размножающихся и спящих паразитов T. cruzi и иммунных эффекторных клеток в целых органах или тканях. Также был успешно принят конвейер CUBIC-HistoVision для получения равномерной маркировки очищенных органов антителами и ядерными пятнами. Очистка тканей в сочетании с 3D-иммуноокрашиванием обеспечивает непредвзятый подход к всесторонней оценке протоколов лечения лекарственными препаратами, улучшает понимание клеточной организации тканей, инфицированных T. cruzi, и, как ожидается, будет способствовать открытиям, связанным с иммунными реакциями против T. cruzi , повреждением тканей и восстановлением при болезни Шагаса.
Introduction
Болезнь Шагаса, вызванная простейшим паразитом T. cruzi, является одной из самых забытых тропических болезней в мире, вызывая около 13 000 ежегодных смертей. Инфекция часто прогрессирует от острой к хронической стадии, вызывая сердечную патологию у 30% пациентов, включая аритмии, сердечную недостаточность и внезапную смерть 1,2. Несмотря на сильный иммунный ответ хозяина, вызванный против паразита во время острой фазы, низкое количество паразитов хронически сохраняется на протяжении всей жизни хозяина в тканях, таких как сердце и скелетные мышцы. Несколько факторов, включая отсроченное начало адаптивных иммунных реакций и наличие нереплицирующих форм паразита, могут способствовать способности T. cruzi избегать полного устранения иммунной системой 3,4,5,6. Кроме того, невоспроизводящиеся спящие формы паразита демонстрируют низкую восприимчивость к трипаноцидным препаратам и могут частично быть ответственны за неудачу лечения, наблюдаемую во многих случаях 7,8.
Разработка новых методов визуализации дает возможность получить представление о пространственном распределении паразитов в инфицированных тканях и их взаимосвязи с иммунными клетками, участвующими в их контроле. Эти характеристики имеют решающее значение для лучшего понимания процессов борьбы с паразитами иммунной системой и отслеживания редких спящих паразитов, присутствующих в хронических тканях.
Светоплавная флуоресцентная микроскопия (LSFM) является одним из наиболее полных и непредвзятых методов для 3D-визуализации крупных тканей или органов без тонкого сечения. Световые микроскопы используют тонкий лист света, чтобы возбуждать только флуорофоры в фокальной плоскости, уменьшать фотоотбеливание и фототоксичность образцов и записывать изображения тысяч слоев тканей с помощью сверхбыстрых камер. Высокий уровень прозрачности тканей, необходимый для правильного проникновения лазерного света в ткани, получен путем гомогенизации показателя преломления (RI) после делипидации и обесцвечивания тканей, что уменьшает рассеяние света и выдаетвысококачественные изображения 9,10,11.
Разработаны подходы к очистке тканей для визуализации целых мышей 12,13,14, органоидов 15,16,17, органов, экспрессирующих репортерные флуоресцентные маркеры 18,19,20,21,22,23, а в последнее время ограниченного числа тканей человека 24 . Современные методы очистки тканей подразделяются на три семейства: (1) методы на основе органических растворителей, такие как протоколы DISCO 25,26, (2) методы на основе гидрогеля, такие как CLARITY27, и водные методы, такие как CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Протоколы CUBIC поддерживают форму органа и целостность тканей, сохраняя флуоресценцию эндогенно экспрессируемых репортерных белков. Самое последнее обновление этого метода, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), также позволяет обнаруживать эпитопы с использованием флуоресцентно меченых антител и маркировки ДНК28.
В настоящем протоколе использовался конвейер CUBIC для обнаружения T. cruzi , экспрессирующих флуоресцентные белки в осветленных интактных тканях мыши. Оптически прозрачные ткани были визуализированы LSFM, реконструированы в 3D, а точное общее количество инфицированных T. cruzi клеток, спящих амастиготов и Т-клеток на орган было автоматически количественно определено. Также этот протокол был успешно принят для получения единообразной маркировки очищенных органов антителами и ядерными пятнами. Эти подходы необходимы для понимания расширения и контроля T. cruzi у инфицированных хозяев и полезны для полной оценки химио- и иммунотерапевтических средств для болезни Шагаса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Отсутствие обширной визуализации целых органов паразитов и иммунного ответа ограничивает понимание сложности взаимодействий хозяина и паразита и затрудняет оценку методов лечения болезни Шагаса. В настоящем исследовании был принят конвейер CUBIC для осветления и окрашивания неповреж…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Эцуо Сусаки за ценную помощь и рекомендации относительно протоколов очистки тканей и иммуноокрашивания. Кроме того, мы благодарны М. Кандасами из CTEGD Biomedical Microscopy Core за техническую поддержку с использованием LSFM и конфокальной визуализации. Мы также благодарим всех членов Исследовательской группы Тарлтона за полезные предложения на протяжении всего этого исследования.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
