Summary

Isolamento di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e cellule mesenchimali palatali coltivate per l'analisi delle fosfoproteine

Published: April 01, 2022
doi:

Summary

Il protocollo presenta un metodo per isolare lisati proteici di cellule intere da processi facciali embrionali di topo sezionati o cellule mesenchimali palatali embrionali di topo in coltura ed eseguire il successivo western blotting per valutare i livelli di proteine fosforilate.

Abstract

Lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi è un processo morfologico complesso durante il quale più popolazioni cellulari si coordinano per generare lo scheletro frontonasale. Questi cambiamenti morfologici sono iniziati e sostenuti attraverso diverse interazioni di segnalazione, che spesso includono la fosforilazione proteica da parte delle chinasi. Qui vengono forniti due esempi di contesti fisiologicamente rilevanti in cui studiare la fosforilazione delle proteine durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi: i processi facciali del topo, in particolare i processi mascellari E11.5, e le cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali di topo in coltura derivate da scaffali palatali secondari E13.5. Per superare la barriera comune della defosforilazione durante l’isolamento proteico, vengono discussi gli adattamenti e le modifiche ai metodi di laboratorio standard che consentono l’isolamento delle fosfoproteine. Inoltre, vengono fornite le migliori pratiche per un’analisi e una quantificazione adeguate delle fosfoproteine a seguito del western blotting dei lisati proteici di cellule intere. Queste tecniche, in particolare in combinazione con inibitori farmacologici e/o modelli genetici murini, possono essere utilizzate per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli di varie fosfoproteine attive durante lo sviluppo craniofacciale.

Introduction

Lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi è un processo morfologico complesso durante il quale più popolazioni cellulari si coordinano per generare lo scheletro frontonasale. Nel topo, questo processo inizia al giorno embrionale (E) 9.5 con la formazione della prominenza frontonasale e coppie di processi mascellari e mandibolari, ognuno dei quali contiene cellule della cresta neurale cranica post-migratoria. I processi nasali laterali e mediali derivano dalla prominenza frontonasale con la comparsa delle fosse nasali e alla fine si fondono per formare le narici. Inoltre, i processi nasali mediali e i processi mascellari si fondono per generare il labbro superiore. Allo stesso tempo, la palatogenesi viene avviata con la formazione di escrescenze distinte – gli scaffali palatali secondari – dal lato orale dei processi mascellari a E11.5. Nel corso del tempo, i ripiani palatali crescono verso il basso su entrambi i lati della lingua, si elevano in una posizione opposta sopra la lingua e alla fine si fondono sulla linea mediana per formare un palato continuo che separa le cavità nasali e orali da E16.51.

Questi cambiamenti morfologici durante lo sviluppo craniofacciale sono iniziati e sostenuti attraverso diverse interazioni di segnalazione, che spesso includono la fosforilazione proteica da parte delle chinasi. Ad esempio, i recettori della membrana cellulare, come le sottofamiglie di recettori del fattore di crescita trasformante (TGF)-β, compresi i recettori delle proteine morfogenetiche ossee (BMMR) e varie famiglie di tirosin-chinasi (RTK), sono autofosforilati dopo il legame del ligando e l’attivazione nelle cellule della cresta neurale cranica 2,3,4 . Inoltre, il recettore transmembrana accoppiato alla proteina G Smoothened diventa fosforilato nelle cellule della cresta neurale cranica e nell’ectoderma craniofacciale a valle del ligando Sonic hedgehog (SHH) che si lega al recettore Patched1, con conseguente accumulo smoothened alla membrana ciliare e attivazione della via SHH5. Tali interazioni ligando-recettore possono avvenire attraverso la segnalazione autocrina, paracrina e/o juxtacrine in contesti craniofacciali. Ad esempio, BMP6 è noto per segnalare in modo autocrino durante la differenziazione dei condrociti6, mentre il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) 8 è espresso nell’ectoderma dell’arco faringeo e si lega ai membri della famiglia FGF di RTK espressi nel mesenchima dell’arco faringeo in modo paracrino per avviare il patterning e la crescita degli archi faringei7, 8,9,10. Inoltre, la segnalazione di Notch viene attivata sia nei condrociti che negli osteoblasti durante lo sviluppo scheletrico craniofacciale attraverso la segnalazione juxtacrine quando i ligandi Delta transmembrana e/o Jagged si legano ai recettori Notch transmembrana sulle cellule vicine, che vengono successivamente scissi e fosforilati11. Tuttavia, ci sono altre coppie di ligando e recettori importanti per lo sviluppo craniofacciale che hanno la flessibilità di funzionare sia nella segnalazione autocrina che paracrina. Ad esempio, durante la morfogenesi dei denti murini, è stato dimostrato che il ligando del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF)-AA segnala in modo autocrino l’attivazione del PDGFRα RTK nell’epitelio12 dell’organo dello smalto. Al contrario, nei processi facciali murini durante la gestazione media, i trascritti che codificano i ligandi PDGF-AA e PDGF-CC sono espressi nell’ectoderma craniofacciale, mentre il recettore PDGFRα è espresso nel mesenchima derivato dalla cresta neurale cranica sottostante, con conseguente segnalazione paracrina 13,14,15,16,17 . Indipendentemente dal meccanismo di segnalazione, questi eventi di fosforilazione del recettore spesso provocano il reclutamento di proteine adattatrici e/o molecole di segnalazione, che spesso si fosforilano per avviare cascate di chinasi intracellulari come la via della chinasi proteica attivata dai mitogeni (MAPK)18,19.

Gli effettori intracellulari terminali di queste cascate possono quindi fosforilare una serie di substrati, come fattori di trascrizione, legame con l’RNA, proteine della matrice citoscheletrica ed extracellulare. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 e Sox926 sono tra i fattori di trascrizione fosforilati nel contesto dello sviluppo craniofacciale. Questa modifica post-traduzionale (PTM) può influenzare direttamente la suscettibilità a PTM alternativi, dimerizzazione, stabilità, scissione e / o affinità di legame con il DNA, tra le altre attività 20,21,25,26. Inoltre, la proteina legante l’RNA Srsf3 è fosforilata nel contesto dello sviluppo craniofacciale, portando alla sua traslocazione nucleare27. In generale, è stato dimostrato che la fosforilazione delle proteine leganti l’RNA influisce sulla loro localizzazione subcellulare, sulle interazioni proteina-proteina, sul legame con l’RNA e/o sulla specificità della sequenza28. Inoltre, la fosforilazione dell’actomiosina può portare a riarrangiamenti citoscheletrici durante lo sviluppo craniofacciale29,30 e la fosforilazione delle proteine della matrice extracellulare, come le glicoproteine legate al ligando N legate all’integrina, contribuisce alla biomineralizzazione durante lo sviluppo scheletrico31. Attraverso quanto sopra e numerosi altri esempi, è evidente che ci sono ampie implicazioni per la fosforilazione delle proteine durante lo sviluppo craniofacciale. Aggiungendo un ulteriore livello di regolazione, la fosforilazione delle proteine è ulteriormente modulata dalle fosfatasi, che contrastano le chinasi rimuovendo i gruppi fosfato.

Questi eventi di fosforilazione sia a livello di recettore che di molecola effettrice sono fondamentali per la propagazione delle vie di segnalazione e alla fine provocano cambiamenti nell’espressione genica nel nucleo, guidando attività cellulari specifiche, come la migrazione, la proliferazione, la sopravvivenza e la differenziazione, che si traducono in una corretta formazione del volto dei mammiferi. Data la specificità del contesto delle interazioni proteiche con chinasi e fosfatasi, i conseguenti cambiamenti nelle PTM e i loro effetti sull’attività cellulare, è fondamentale che questi parametri siano studiati in un contesto fisiologicamente rilevante per ottenere una comprensione completa del contributo degli eventi di fosforilazione allo sviluppo craniofacciale. Qui vengono forniti esempi di due contesti in cui studiare la fosforilazione delle proteine e, quindi, l’attivazione delle vie di segnalazione durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi: i processi facciali dei topi, in particolare i processi mascellari E11.5, e le cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo in coltura derivate da scaffali palatali secondari E13.5 – entrambi primari32 e immortalati33 . A E11.5, i processi mascellari sono in fase di fusione con i processi nasali laterali e mediali1, rappresentando così un punto temporale critico durante lo sviluppo craniofacciale del topo. Inoltre, i processi mascellari e le cellule derivate dagli scaffali palatali sono stati scelti qui perché queste ultime strutture sono derivati delle prime, fornendo così ai ricercatori l’opportunità di interrogare la fosforilazione proteica in vivo e in vitro in contesti correlati. Tuttavia, questo protocollo è applicabile anche a processi facciali alternativi e punti temporali di sviluppo.

Un problema critico nello studio delle proteine fosforilate è che sono facilmente defosforilate durante l’isolamento proteico da abbondanti fosfatasi ambientali. Per superare questa barriera, vengono discussi gli adattamenti e le modifiche ai metodi di laboratorio standard che consentono l’isolamento delle proteine fosforilate. Inoltre, vengono fornite le migliori pratiche per un’analisi e una quantificazione adeguate delle proteine fosforilate. Queste tecniche, in particolare in combinazione con inibitori farmacologici e/o modelli genetici murini, possono essere utilizzate per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli delle varie vie di segnalazione attive durante lo sviluppo craniofacciale.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università del Colorado Anschutz Medical Campus ed eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti istituzionali. Per la raccolta di embrioni sono stati utilizzati topi femmina 129S4 a 1,5-6 mesi di età e alloggiati a una temperatura sub-termoneutrica di 21-23 °C. Un flusso di lavoro schematico del protocollo è rappresentato nella Figura 1. Vedere l…

Representative Results

Quando si tenta di caratterizzare la fosforilazione di proteine isolate da processi facciali di topo e/o cellule mesenchimali palatali in coltura, i risultati rappresentativi riveleranno idealmente una banda distinta e riproducibile dopo il western blotting con un anticorpo antifosfoproteico che corre all’altezza o vicino all’altezza della corrispondente banda proteica totale (Figura 3 ). Tuttavia, se si verifica un’estesa fosforilazione della proteina, potrebbe esserci un leggero spostament…

Discussion

Il protocollo qui descritto consente ai ricercatori di sondare eventi critici di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione durante lo sviluppo craniofacciale in modo robusto e riproducibile. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che garantiscono una corretta raccolta di dati e l’analisi dei risultati. Che si tratti di isolare le fosfoproteine dai processi facciali dei topi e / o dalle cellule mesenchimali palatali in coltura, è imperativo muoversi in modo rapido ed efficiente mantenendo tutti i reagen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

129S4 topi sono stati un dono del Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine del Monte Sinai. Questo lavoro è stato sostenuto con fondi dal National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 e K02 DE028572 a K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. e F31 DE029364 a B.J.C.D.

Materials

Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca – 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

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Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).

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