L’épuisement extracellulaire du glucose comme mesure indirecte de l’absorption du glucose dans les cellules et les tissus Ex Vivo

La demande pour mesurer l’absorption du glucose augmente avec le besoin critique de faire face à une augmentation épidémique d’une multitude de maladies dépendantes du métabolisme du glucose. Les mécanismes sous-jacents des maladies métaboliques dégénératives, des troubles neurologiques et cognitifs¹, des maladies inflammatoires² et infectieuses³, du cancer ^4,5, ainsi que du vieillissement 6, dépendent du métabolisme du glucose pour l’énergie et son stockage, les processus anabolisants, la modification des protéines et des gènes, la signalisation, la régulation des gènes et la synthèse et la réplication des acides nucléiques ^7,8,9 . Le diabète sucré (DM) est directement lié à un dysfonctionnement de la régulation de l’absorption du glucose. Le DM est un spectre de maladies chroniques telles que le diabète sucré de type 1, -2 et -3, le diabète gestationnel, le diabète de maturité des jeunes et d’autres types de cette maladie induite par des facteurs environnementaux et / ou génétiques. En 2016, le premier rapport mondial de l’OMS sur le diabète a démontré que le nombre d’adultes vivant avec le DIABÈTE le plus répandu a presque quadruplé depuis 1980 pour atteindre 422 millions d’adultes¹⁰, et ce nombre de patients atteints de diabète a augmenté de façon exponentielle au cours des dernières décennies. Rien qu’en 2019, on estime à 1,5 million le nombre de décès directement causés par¹⁰ DM. Cette recrudescence spectaculaire est due à l’augmentation du diabète de type 2 et aux conditions qui l’animent, notamment le surpoids et l’obésité¹⁰. La pandémie de COVID-19 a révélé une double augmentation de la mortalité chez les patients atteints de DM par rapport à la population générale, suggérant le rôle profond mais mal compris du métabolisme du glucose dans la défense immunitaire³. La prévention, le diagnostic précoce et le traitement de la DM, de l’obésité et d’autres maladies nécessitent l’optimisation des mesures de l’absorption du glucose par différents tissus et l’identification des facteurs^{environnementaux 11},^{nutritionnels 12}, endocriniens^{13, génétiques 14} et épigénétiques¹⁵ affectant l’absorption du glucose.

Dans la recherche, l’absorption intracellulaire et / ou tissulaire du glucose est généralement mesurée par le glucose marqué par fluorescence (FD-glucose) in vitro 16,17,18 et in vivo¹⁹. Le FD-glucose est devenu une méthode préférée par rapport aux méthodes plus précises utilisant le glucose²⁰ marqué radioactivement, l’analyse par spectroscopie de masse analytique²¹, la métabolomique²², les méthodes de résonance magnétique nucléaire²³ et la tomographie par émission de positons / tomodensitométrie (TEP / CT) ^5,24. Contrairement à l’absorption du glucose FD, les méthodes d’analyse nécessitant plus de matériel biologique peuvent impliquer une préparation d’échantillon en plusieurs étapes, des instruments coûteux et une analyse complexe des données. Des mesures efficaces et peu coûteuses de l’absorption du FD-glucose dans les cultures cellulaires ont été utilisées dans des expériences de preuve de concept et peuvent nécessiter une validation par d’autres méthodes.

La base de l’application de FD-glucose pour les études d’absorption du glucose est le métabolisme réduit du FD-glucose par rapport au glucose endogène²⁵. Néanmoins, le glucose endogène et le FD-glucose sont répartis dynamiquement entre tous les compartiments cellulaires pour une utilisation dans les processus anabolisants, cataboliques et de signalisation. Le compartimentage et le traitement dépendant du temps²⁵ du FD-glucose interfèrent avec les mesures de fluorescence et représentent les principaux facteurs limitant l’utilisation de ce test dans les expériences de criblage à haut débit, l’analyse cinétique, la culture cellulaire 3D, les co-cultures et les expériences d’explantation tissulaire. Ici, nous fournissons des données démontrant une forte corrélation entre l’épuisement extracellulaire du FD-glucose et son absorption intracellulaire, suggérant l’épuisement extracellulaire du FD-glucose comme mesure de substitution de l’absorption intracellulaire du glucose. La mesure de l’épuisement extracellulaire du glucose a été appliquée pour valider les différences tissulaires dans l’absorption du glucose chez les souris traitées avec de l’insuline et un médicament expérimental¹⁸ pour fournir une preuve de principe de cette méthode.

Le protocole actuel décrit les mesures intracellulaires et extracellulaires (Figure 1) de l’absorption du FD-glucose dans les cellules 3T3-L1. Les sections 1 à 7 du protocole expliquent la culture et la croissance des cellules pendant 48 h; la famine cellulaire, la stimulation et les mesures extracellulaires de base; et les mesures post-stimulation du FD-glucose extracellulaire et les mesures intracellulaires du FD-glucose et des protéines. La section 8 du protocole décrit la mesure ex vivo de l’absorption extracellulaire du FD-glucose dans les tissus disséqués de souris ob/ob en présence et en l’absence d’insuline et de composé d’acides aminés 2 (CAA2) décrite ailleurs¹⁸.