Extracellulaire glucosedepletie als een indirecte maat voor glucoseopname in cellen en weefsels Ex Vivo

De vraag naar het meten van glucoseopname stijgt samen met de kritieke noodzaak om een epidemische toename van een groot aantal ziekten aan te pakken die afhankelijk zijn van het glucosemetabolisme. Onderliggende mechanismen van degeneratieve metabole ziekten, neurologische en cognitieve^{aandoeningen 1}, ontsteking² en infectieziekten³, kanker ^4,5, evenals veroudering⁶, zijn afhankelijk van glucosemetabolisme voor energie en de opslag ervan, anabole processen, eiwit- en genmodificatie, signalering, regulatie van genen en nucleïnezuren synthese en replicatie ^7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) is direct gerelateerd aan een storing in de glucose-opnameregulatie. DM is een spectrum van chronische ziekten zoals type-1, -2 en -3 diabetes mellitus, zwangerschapsdiabetes, volwassenheidsdiabetes van jongeren en andere soorten van deze ziekte veroorzaakt door omgevings- en / of genetische factoren. In 2016 toonde het eerste who global report on diabetes aan dat het aantal volwassenen met de meest wijdverspreide DM sinds 1980 bijna is verviervoudigd tot 422 miljoen volwassenen¹⁰, en dit aantal DM-patiënten is de afgelopen decennia exponentieel gestegen. Alleen al in 2019 werd een schatting van 1,5 miljoen sterfgevallen direct veroorzaakt door DM¹⁰. Deze dramatische stijging is te wijten aan de toename van type-2 DM en de omstandigheden die het veroorzaken, waaronder overgewicht en obesitas¹⁰. De COVID-19-pandemie onthulde een tweevoudige toename van de mortaliteit bij patiënten met DM in vergelijking met de algemene bevolking, wat de diepgaande maar slecht begrepen rol van glucosemetabolisme in de immuunafweer suggereert³. Preventie, vroege diagnose en behandeling van DM, obesitas en andere ziekten vereisen optimalisatie van metingen van glucoseopname door verschillende weefsels en identificatie van^{omgevingsfactoren 11}, voeding¹², endocriene^{13, genetische 14} en epigenetische¹⁵ factoren die de glucoseopname beïnvloeden.

In onderzoek wordt intracellulaire en/of weefselopname van glucose gewoonlijk gemeten door fluorescerend gelabelde glucose (FD-glucose) in vitro 16,17,18 en in vivo¹⁹. FD-glucose werd een voorkeursmethode in vergelijking met nauwkeurigere methoden met behulp van radioactief gelabelde glucose²⁰, analytische massaspectroscopieanalyse²¹, metabolomica²², nucleaire magnetische resonantiemethoden²³ en positronemissietomografie / computertomografie (PET / CT) ^5,24. In tegenstelling tot de opname van FD-glucose, kunnen analytische methoden die meer biologisch materiaal vereisen, een monstervoorbereiding in meerdere stappen, dure instrumenten en complexe gegevensanalyse omvatten. Effectieve en goedkope metingen van FD-glucoseopname in celculturen zijn gebruikt in proof-of-concept-experimenten en vereisen mogelijk validatie door andere methoden.

De basis van FD-glucosetoepassing voor glucoseopnamestudies is het verminderde metabolisme van FD-glucose in vergelijking met endogene glucose²⁵. Niettemin zijn zowel endogene glucose als FD-glucose dynamisch verdeeld over alle cellulaire compartimenten voor gebruik in anabole, katabole en signaleringsprocessen. De compartimentering en tijdsafhankelijke verwerking²⁵ van FD-glucose interfereren met de fluorescentiemetingen en vertegenwoordigen de belangrijkste beperkende factoren voor het gebruik van deze test in screeningexperimenten met hoge doorvoer, kinetische analyse, 3D-celkweek, coculturen en weefselexplantexplantexperimenten. Hier bieden we gegevens die een hoge correlatie aantonen tussen de extracellulaire depletie van FD-glucose en de intracellulaire opname ervan, wat de extracellulaire uitputting van FD-glucose suggereert als een surrogaatmeting voor intracellulaire glucoseopname. De meting van extracellulaire depletie van glucose werd toegepast om weefselspecifieke verschillen in glucoseopname te valideren bij muizen behandeld met insuline en een experimenteel medicijn¹⁸ om een proof-of-principle van deze methode te bieden.

Het huidige protocol beschrijft intracellulaire en extracellulaire (figuur 1) metingen van FD-glucoseopname in 3T3-L1-cellen. Protocol secties 1-7 verklaren de cultuur en groei van cellen gedurende 48 uur; celuithongering, stimulatie en baseline extracellulaire metingen; en poststimulatiemetingen van extracellulaire FD-glucose en intracellulaire metingen van FD-glucose en eiwit. Protocol sectie 8 beschrijft de ex vivo meting van extracellulaire opname van FD-glucose in weefsels ontleed van ob/ob muizen in de aan- en afwezigheid van insuline en aminozuurverbinding 2 (AAC2) elders beschreven¹⁸.