استنفاد الجلوكوز خارج الخلية كمقياس غير مباشر لامتصاص الجلوكوز في الخلايا والأنسجة خارج الجسم الحي
Summary
يرتبط النضوب خارج الخلية للجلوكوز الموسوم بالفلورسنت بامتصاص الجلوكوز ويمكن استخدامه للفحص عالي الإنتاجية لامتصاص الجلوكوز في الأعضاء المستثناة ومزارع الخلايا.
Abstract
يزيد وباء السكري المستمر في جميع أنحاء العالم من الطلب على تحديد العوامل البيئية والغذائية والغدد الصماء والوراثية واللاجينية التي تؤثر على امتصاص الجلوكوز. يعد قياس التألق داخل الخلايا طريقة تستخدم على نطاق واسع لاختبار امتصاص الجلوكوز المسمى بالفلورسنت (FD-glucose) في الخلايا في المختبر ، أو لتصوير الأنسجة المستهلكة للجلوكوز في الجسم الحي. يقيم هذا الفحص امتصاص الجلوكوز في نقطة زمنية مختارة. يفترض التحليل داخل الخلايا أن عملية التمثيل الغذائي للجلوكوز FD أبطأ من استقلاب الجلوكوز الداخلي ، الذي يشارك في التفاعلات والإشارات الهدامة والمبتنائية. ومع ذلك ، فإن استقلاب الجلوكوز الديناميكي يغير أيضا آليات الامتصاص ، الأمر الذي يتطلب قياسات حركية لامتصاص الجلوكوز استجابة لعوامل مختلفة. توضح هذه المقالة طريقة لقياس استنفاد الجلوكوز FD-CELLULAR والتحقق من ارتباطها بامتصاص الجلوكوز FD-داخل الخلايا في الخلايا والأنسجة خارج الجسم الحي. قد يكون استنفاد الجلوكوز خارج الخلية قابلا للتطبيق على الدراسات الحركية عالية الإنتاجية والمعتمدة على الجرعة ، بالإضافة إلى تحديد المركبات ذات النشاط الجلايسيمي وآثارها الخاصة بالأنسجة.
Introduction
يرتفع الطلب على قياس امتصاص الجلوكوز جنبا إلى جنب مع الحاجة الماسة لمعالجة الزيادة الوبائية في العديد من الأمراض التي تعتمد على استقلاب الجلوكوز. تعتمد الآليات الكامنة وراء الأمراض الأيضية التنكسية والاضطرابات العصبية والمعرفية1 والالتهابات2 والأمراض المعدية3 والسرطان4,5 ، وكذلك الشيخوخة6 ، على استقلاب الجلوكوز للطاقة وتخزينها ، وعمليات الابتنائية ، والبروتين ، وتعديل الجينات ، والإشارات ، وتنظيم الجينات ، وتخليق الأحماض النووية وتكرارها 7,8,9 . يرتبط داء السكري (DM) ارتباطا مباشرا بخلل في تنظيم امتصاص الجلوكوز. DM هو مجموعة من الأمراض المزمنة مثل داء السكري من النوع 1 و -2 و -3 ، وسكري الحمل ، ومرض السكري عند بدء النضج لدى الشباب ، وأنواع أخرى من هذا المرض الناجم عن العوامل البيئية و / أو الوراثية. في عام 2016 ، أظهر أول تقرير عالمي لمنظمة الصحة العالمية عن مرض السكري أن عدد البالغين الذين يعيشون مع DM الأكثر انتشارا قد تضاعف أربع مرات تقريبا منذ عام 1980 إلى 422 مليون بالغ10 ، وهذا العدد من مرضى DM آخذ في الارتفاع بشكل كبير على مدى العقود القليلة الماضية. في عام 2019 وحده ، كان تقدير 1.5 مليون حالة وفاة ناتجا مباشرة عن DM10. ويرجع هذا الارتفاع الكبير إلى ارتفاع النوع 2 DM والظروف التي تقوده ، بما في ذلك زيادة الوزن والسمنة10. كشفت جائحة COVID-19 عن زيادة بمقدار الضعف في معدل الوفيات لدى المرضى الذين يعانون من DM مقارنة بعامة السكان ، مما يشير إلى الدور العميق ولكن غير المفهوم جيدا لاستقلاب الجلوكوز في الدفاع المناعي3. تتطلب الوقاية والتشخيص المبكر والعلاج من DM والسمنة والأمراض الأخرى تحسين قياسات امتصاص الجلوكوز بواسطة الأنسجة المختلفة ، وتحديد العوامل البيئية11 والغذائية 12 والغدد الصماء 13 والجينية14 والعوامل اللاجينية 15 التي تؤثر على امتصاص الجلوكوز.
في الأبحاث ، يتم قياس امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا و / أو الأنسجة بشكل شائع بواسطة الجلوكوز المسمى بالفلورسنت (FD-glucose) في المختبر16،17،18 وفي الجسم الحي19. أصبح FD-glucose طريقة مفضلة مقارنة بالطرق الأكثر دقة باستخدام الجلوكوز 20 المسمى إشعاعيا ، وتحليل التحليل الطيفي للكتلةالتحليلي 21 ، والأيض 22 ، وطرق الرنين المغناطيسي النووي 23 ، والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي المحوسب (PET / CT) 5,24. على عكس امتصاص الجلوكوز FD ، قد تتضمن الطرق التحليلية التي تتطلب المزيد من المواد البيولوجية إعداد عينة متعددة الخطوات ، وأدوات باهظة الثمن ، وتحليل البيانات المعقدة. تم استخدام قياسات فعالة وغير مكلفة لامتصاص الجلوكوز FD في مزارع الخلايا في تجارب إثبات المفهوم وقد تتطلب التحقق من الصحة بطرق أخرى.
أساس تطبيق FD-glucose لدراسات امتصاص الجلوكوز هو انخفاض التمثيل الغذائي للجلوكوز FD-glucose مقارنة بالجلوكوز الداخلي25. ومع ذلك ، يتم توزيع كل من الجلوكوز الداخلي والجلوكوز FD ديناميكيا بين جميع المقصورات الخلوية للاستخدام في العمليات الابتنائية والهدامية والإشارات. يتداخل التقسيم والمعالجة المعتمدة على الوقت25 من FD-glucose مع قياسات التألق ، ويمثل العوامل المحددة الرئيسية لاستخدام هذا الفحص في تجارب الفحص عالية الإنتاجية ، والتحليل الحركي ، وزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، والثقافات المشتركة ، وتجارب إكسبورت الأنسجة. هنا ، نقدم بيانات توضح وجود علاقة عالية بين استنفاد الجلوكوز خارج الخلية من الجلوكوز FD وامتصاصه داخل الخلايا ، مما يشير إلى استنفاد الجلوكوز خارج الخلية من الجلوكوز FD كقياس بديل لامتصاص الجلوكوز داخل الخلايا. تم تطبيق قياس استنفاد الجلوكوز خارج الخلية للتحقق من صحة الاختلافات الخاصة بالأنسجة في امتصاص الجلوكوز في الفئران المعالجة بالأنسولين ودواء تجريبي18 لتوفير دليل على مبدأ هذه الطريقة.
يصف البروتوكول الحالي قياسات داخل الخلايا وخارجها (الشكل 1) لامتصاص الجلوكوز FD في خلايا 3T3-L1. تشرح أقسام البروتوكول 1-7 زراعة الخلايا ونموها لمدة 48 ساعة ؛ تجويع الخلايا ، والتحفيز ، والقياسات الأساسية خارج الخلية ؛ وقياسات ما بعد التحفيز لجلوكوز FD-الجلوكوز خارج الخلية والقياسات داخل الخلايا لجلوكوز FD والبروتين. يصف قسم البروتوكول 8 القياس خارج الجسم الحي للامتصاص خارج الخلية من الجلوكوز FD في الأنسجة التي تم تشريحها من الفئران ob / ob في وجود وغياب الأنسولين ومركب الأحماض الأمينية 2 (AAC2) الموصوف في مكان آخر18.
Protocol
Representative Results
Discussion
أظهرت المقارنة المباشرة لاستنفاد الجلوكوز خارج الخلية مع امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا الطبيعي في مزرعة الخلايا وجود علاقة عالية ، مما يشير إلى أن استنفاد الجلوكوز خارج الخلية يمكن أن يكون قياسا بديلا لتقييم امتصاص الجلوكوز. يمكن أن يستخدم قياس الجلوكوز FD-glucose خارج الخلية مجموعة واسعة من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم المشروع من قبل جائزة رالف وماريان فالك لمحفز البحوث الطبية وجائزة كاثلين كيلي. وشملت الإعانات الأخرى المركز الوطني للموارد البحثية UL1RR025755 و NCI P30CA16058 (OSUCCC) ، وخارطة طريق المعاهد الوطنية للصحة للبحوث الطبية. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل وجهات النظر الرسمية للمركز الوطني لموارد البحوث أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
