דלדול גלוקוז חוץ-תאי כמדד עקיף לספיגת גלוקוז בתאים וברקמות Ex Vivo
Summary
דלדול חוץ-תאי של גלוקוז המסומן באופן פלואורסצנטי מתואם עם ספיגת גלוקוז, וניתן להשתמש בו לבדיקת תפוקה גבוהה של ספיגת גלוקוז באיברים שנכרתו ובתרביות תאים.
Abstract
המגיפה העולמית המתמשכת של סוכרת מגבירה את הביקוש לזיהוי גורמים סביבתיים, תזונתיים, אנדוקריניים, גנטיים ואפיגנטיים המשפיעים על ספיגת גלוקוז. מדידת פלואורסצנציה תוך-תאית היא שיטה נפוצה לבדיקת ספיגת גלוקוז המסומן בפלואורסצנטיות (FD-glucose) בתאים במבחנה, או להדמיית רקמות הצורכות גלוקוז in vivo. מחקר זה מעריך את ספיגת הגלוקוז בנקודת זמן נבחרת. הניתוח התוך-תאי מניח כי חילוף החומרים של FD-גלוקוז איטי יותר מזה של גלוקוז אנדוגני, המשתתף בתגובות ואיתות קטבוליים ואנבוליים. עם זאת, חילוף החומרים הדינמי של הגלוקוז משנה גם את מנגנוני הספיגה, מה שידרוש מדידות קינטיות של ספיגת גלוקוז בתגובה לגורמים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת דלדול FD-גלוקוז חוץ-תאי ומאמת את המתאם שלה עם ספיגת FD-גלוקוז תוך-תאית בתאים וברקמות ex vivo. דלדול גלוקוז חוץ-תאי עשוי להיות ישים פוטנציאלית למחקרים קינטיים ותלויי מינון בתפוקה גבוהה, כמו גם לזיהוי תרכובות עם פעילות גליקמית והשפעותיהן הספציפיות לרקמות.
Introduction
הביקוש למדידת ספיגת גלוקוז עולה יחד עם הצורך הקריטי לטפל בעלייה במגפה במספר רב של מחלות התלויות בחילוף החומרים של הגלוקוז. המנגנונים הבסיסיים של מחלות מטבוליות ניווניות, הפרעות נוירולוגיות וקוגניטיביות1, דלקת2 ומחלות זיהומיות3, סרטן 4,5, כמו גם הזדקנות6, תלויים בחילוף החומרים של גלוקוז לאנרגיה ולאגירתה, תהליכים אנבוליים, חלבון ושינוי גנים, איתות, ויסות גנים וסינתזה ושכפול של חומצות גרעין 7,8,9 . סוכרת (DM) קשורה ישירות לתקלה בוויסות ספיגת הגלוקוז. DM הוא ספקטרום של מחלות כרוניות כגון סוכרת מסוג 1, -2 ו -3, סוכרת הריונית, סוכרת הריון, סוכרת בשלות של צעירים, וסוגים אחרים של מחלה זו הנגרמת על ידי גורמים סביבתיים ו / או גנטיים. בשנת 2016, הדו”ח הגלובלי הראשון של ארגון הבריאות העולמי על סוכרת הראה כי מספר המבוגרים החיים עם ה- DM הנפוץ ביותר כמעט הוכפל פי ארבעה מאז 1980 ל -422 מיליון מבוגרים10, ומספר זה של חולי DM עלה באופן אקספוננציאלי בעשורים האחרונים. בשנת 2019 לבדה, הערכה של 1.5 מיליון מקרי מוות נגרמה ישירות על ידי DM10. עלייה דרמטית זו נובעת מהעלייה ב-DM מסוג 2 ומהתנאים המניעים אותו, כולל עודף משקל והשמנת יתר10. מגפת COVID-19 חשפה עלייה של פי שניים בתמותה בקרב חולי דושן בהשוואה לאוכלוסייה הכללית, מה שמרמז על התפקיד העמוק אך הלא מובן של חילוף החומרים של גלוקוז בהגנה החיסונית3. מניעה, אבחון מוקדם וטיפול ב-DM, השמנת יתר ומחלות אחרות דורשים אופטימיזציה של מדידות של ספיגת גלוקוז על ידי רקמות שונות, וזיהוי של גורמים סביבתיים11, תזונתיים12, אנדוקריניים13,גנטיים 14, ו-15 אפיגנטיים המשפיעים על ספיגת גלוקוז.
במחקר, ספיגה תוך-תאית ו/או רקמות של גלוקוז נמדדת בדרך כלל על-ידי גלוקוז המסומן בפלואורסצנט (FD-גלוקוז) במבחנה 16,17,18 ו-in vivo19. FD-גלוקוז הפך לשיטה מועדפת בהשוואה לשיטות מדויקות יותר באמצעות גלוקוז מסומןרדיואקטיבית 20, ניתוח ספקטרוסקופיית מסה אנליטית21, מטבוליקה22, שיטות תהודה מגנטית גרעינית23, וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת (PET/CT)5,24. שלא כמו ספיגת גלוקוז FD, שיטות אנליטיות הדורשות יותר חומר ביולוגי עשויות לכלול הכנת דגימה רב-שלבית, מכשירים יקרים וניתוח נתונים מורכב. מדידות יעילות וזולות של ספיגת FD-גלוקוז בתרביות תאים שימשו בניסויי הוכחת היתכנות ועשויות לדרוש אימות בשיטות אחרות.
הבסיס ליישום FD-גלוקוז למחקרי ספיגת גלוקוז הוא חילוף החומרים המופחת של FD-גלוקוז בהשוואה לגלוקוז אנדוגני25. עם זאת, הן גלוקוז אנדוגני והן FD-גלוקוז מופצים באופן דינמי בין כל התאים התאיים לשימוש בתהליכים אנאבוליים, קטבוליים ואיתות. המידור והעיבוד תלוי הזמן25 של FD-גלוקוז מפריעים למדידות הפלואורסצנטיות, ומייצגים את הגורמים המגבילים העיקריים לשימוש בבדיקה זו בניסויי סינון בתפוקה גבוהה, ניתוח קינטי, תרבית תאים תלת-ממדית, תרביות משותפות וניסויי הסבר רקמות. כאן אנו מספקים נתונים המדגימים מתאם גבוה בין הידלדלות החוץ-תאית של גלוקוז FD לבין ספיגתו התוך-תאית, מה שמצביע על הידלדלות חוץ-תאית של FD-גלוקוז כמדידה פונדקאית לספיגת גלוקוז תוך-תאי. המדידה של דלדול חוץ-תאי של גלוקוז יושמה כדי לאמת הבדלים ספציפיים לרקמות בספיגת הגלוקוז בעכברים שטופלו באינסולין ובתרופה ניסיונית18 כדי לספק הוכחה עקרונית לשיטה זו.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידות תוך-תאיות וחוץ-תאיות (איור 1) של ספיגת FD-גלוקוז בתאי 3T3-L1. סעיפי פרוטוקול 1-7 מסבירים את התרבית והצמיחה של תאים במשך 48 שעות; הרעבת תאים, גירוי ומדידות חוץ-תאיות בסיסיות; ומדידות לאחר גירוי של FD-גלוקוז חוץ-תאי ומדידות תוך-תאיות של FD-גלוקוז וחלבון. פרוטוקול סעיף 8 מתאר את מדידת ה-ex vivo של ספיגה חוץ-תאית של FD-גלוקוז ברקמות שנותחו מעכברי ob/ob בנוכחות והיעדר תרכובת אינסולין וחומצות אמינו 2 (AAC2) שתוארה במקום אחר18.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההשוואה הישירה של דלדול FD-גלוקוז חוץ-תאי עם ספיגת גלוקוז תוך-תאית מנורמלת בתרבית תאים הראתה מתאם גבוה, מה שמרמז על כך שהתרוקנות גלוקוז חוץ-תאית עשויה להיות מדידה פונדקאית להערכת ספיגת גלוקוז. המדידה של FD-גלוקוז חוץ-תאי יכולה להשתמש במגוון רחב של ריכוזי גלוקוז FD, וגם 0.5-2.5 מיקרוגרם FD-גלוקוז/מ”…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט נתמך על ידי פרס ראלף ומריאן פאלק למחקר רפואי ופרס קתלין קלי. תמיכות אחרות כללו את המרכז הלאומי למשאבי מחקר UL1RR025755 ואת NCI P30CA16058 (OSUCCC), מפת הדרכים של NIH למחקר רפואי. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג את הדעות הרשמיות של המרכז הלאומי למשאבי מחקר או של ה-NIH.
Materials
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
