세포 외 포도당 고갈은 세포 및 조직 Ex vivo 에서 포도당 흡수의 간접적 인 척도로서
Summary
형광 표지된 글루코스의 세포외 고갈은 글루코스 흡수와 상관관계가 있으며, 적출된 기관 및 세포 배양물에서 글루코스 흡수의 고처리량 스크리닝에 사용될 수 있다.
Abstract
전 세계적으로 진행중인 당뇨병 유행은 포도당 섭취에 영향을 미치는 환경, 영양, 내분비, 유전 및 후성 유전 적 요인의 확인에 대한 수요를 증가시킵니다. 세포내 형광의 측정은 시험관 내에서 세포에서 형광 표지된 글루코스(FD-glucose)의 흡수를 시험하거나 생체내에서 글루코스 소비 조직을 영상화하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 이 분석은 선택된 시점에서 글루코스 흡수를 평가합니다. 세포 내 분석은 FD-글루코스의 신진 대사가 이화 작용 및 단백 동화 반응 및 신호 전달에 참여하는 내인성 포도당의 신진 대사보다 느리다고 가정합니다. 그러나 동적 포도당 대사는 또한 흡수 메커니즘을 변경하며, 이는 다양한 요인에 대한 반응으로 포도당 섭취의 운동 학적 측정이 필요합니다. 이 글에서는 세포외 FD-글루코스 고갈을 측정하는 방법을 설명하고, 세포 및 조직 ex 생체내에서 세포내 FD-글루코스 흡수와의 상관관계를 검증한다. 세포외 글루코스 고갈은 고처리량 동역학 및 용량-의존적 연구뿐만 아니라 혈당 활성 및 그들의 조직-특이적 효과를 갖는 화합물을 확인하는 데 잠재적으로 적용될 수 있다.
Introduction
포도당 섭취량 측정에 대한 요구는 포도당 대사에 의존하는 수많은 질병의 전염병 증가를 해결해야 할 중요한 필요성과 함께 증가합니다. 퇴행성 대사성 질환, 신경 및인지 장애1, 염증성2 및 전염병3, 암4,5 및 노화6의 기본 메커니즘은 에너지 및 그 저장, 단백 동화 과정, 단백질 및 유전자 변형, 신호 전달, 유전자의 조절, 핵산 합성 및 복제에 대한 포도당 대사에 의존합니다 7,8,9 . 당뇨병 (DM)은 포도당 흡수 조절의 오작동과 직접 관련이 있습니다. DM은 제1형, -2형, -3형 진성 당뇨병, 임신성 당뇨병, 젊은 성숙 발병 당뇨병 및 환경 및/또는 유전적 요인에 의해 유발되는 다른 유형의 질환과 같은 만성 질환의 스펙트럼이다. 2016 년 당뇨병에 관한 최초의 WHO 글로벌 보고서에 따르면 가장 널리 퍼진 DM을 앓고있는 성인의 수는 1980 년 이후 422 백만 명의 성인10 명으로 거의 4 배로 증가했으며이 DM 환자 수는 지난 수십 년 동안 기하 급수적으로 증가하고 있습니다. 2019 년에만 DM10에 의해 1.5 백만 명의 사망자가 직접 발생한 것으로 추정됩니다. 이러한 극적인 상승은 유형 2 DM의 증가와 과체중 및 비만10을 포함하여 그것을 유발하는 조건 때문입니다. COVID-19 전염병은 일반 인구에 비해 DM 환자의 사망률이 두 배 증가한 것으로 나타 났으며, 이는 면역 방어에서 포도당 대사의 심오하지만 잘 이해되지 않은 역할을 시사합니다3. DM, 비만 및 기타 질병의 예방, 조기 진단 및 치료에는 다양한 조직에 의한 포도당 흡수 측정의 최적화와 포도당 섭취에 영향을 미치는 환경 11, 영양 12, 내분비13, 유전 적14 및 후성 유전 학적 15 요인의 확인이 필요합니다.
연구에서, 글루코스의 세포내 및/또는 조직 흡수는 일반적으로 시험관내 16,17,18 및 생체내19에서 형광 표지된 글루코스(FD-glucose)에 의해 측정된다. FD-글루코오스는 방사성 표지된 글루코스 20, 분석 질량 분광법 분석 21, 대사체학 22, 핵 자기 공명 방법(23), 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영(PET/CT)5,24를 사용하는 보다 정밀한 방법에 비해 선호되는 방법이 되었다. FD-글루코스 섭취와는 달리, 더 많은 생물학적 물질을 필요로 하는 분석 방법에는 다단계 샘플 준비, 고가의 장비 및 복잡한 데이터 분석이 포함될 수 있습니다. 세포 배양물에서 FD-글루코스 흡수의 효과적이고 저렴한 측정은 개념 증명 실험에 활용되었으며 다른 방법에 의한 검증이 필요할 수 있습니다.
포도당 흡수 연구를위한 FD-글루코스 적용의 기초는 내인성 포도당25에 비해 FD-포도당의 신진 대사 감소입니다. 그럼에도 불구하고, 내인성 글루코스와 FD-글루코오스 둘 모두는 동화작용, 이화작용 및 신호전달 과정에 사용하기 위해 모든 세포 구획들 사이에 동적으로 분포된다. FD-글루코오스의 구획화 및 시간 의존적 처리(25 )는 형광 측정을 방해하고, 고처리량 스크리닝 실험, 동역학 분석, 3D 세포 배양, 공동 배양, 및 조직 외래 실험에서 이러한 분석의 사용에 대한 주요 제한 인자를 나타낸다. 여기에서, 우리는 FD-글루코스의 세포외 고갈과 그 세포내 흡수 사이의 높은 상관관계를 보여주는 데이터를 제공하여, 세포내 글루코스 흡수를 위한 대리 측정으로서 FD-글루코오스의 세포외 고갈을 시사한다. 글루코스의 세포외 고갈의 측정은 이 방법의 원리 증명을 제공하기 위해 인슐린 및 실험 약물18 로 처리된 마우스에서 글루코스 흡수의 조직 특이적 차이를 검증하기 위해 적용되었다.
현재 프로토콜은 3T3-L1 세포에서 FD-글루코스 흡수의 세포내 및 세포외(그림 1) 측정을 기술한다. 프로토콜 섹션 1-7은 48 h 동안 세포의 배양 및 성장을 설명합니다. 세포 기아, 자극, 및 기준선 세포외 측정; 및 세포외 FD-글루코오스의 자극 후 측정 및 FD-글루코스 및 단백질의 세포내 측정. 프로토콜 섹션 8은 다른 곳(18)에 기술된 인슐린 및 아미노산 화합물 2(AAC2)의 존재 및 부재 하에 ob/ob 마우스로부터 해부된 조직에서 FD-글루코스의 세포외 흡수의 생체외 측정을 기술한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포외 FD-글루코스 고갈과 세포 배양에서의 정상화된 세포내 글루코스 흡수의 직접적인 비교는 높은 상관관계를 나타냈으며, 이는 세포외 글루코스 고갈이 글루코스 흡수 평가를 위한 대리 측정이 될 수 있음을 시사한다. 세포외 FD-글루코스의 측정은 광범위한 FD 글루코스 농도를 사용할 수 있으며, 또한 0.5-2.5 μg FD-글루코스 / mL가 최적의 범위를 제공하는 것으로 보입니다. 세포외 FD-글루코오스?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 Ralph와 Marian Falk Medical Research Catalyst Award와 Kathleen Kelly Award의 지원을 받았습니다. 다른 지원으로는 국립 연구 자원 센터 UL1RR025755 및 NCI P30CA16058 (OSUCCC), 의학 연구를위한 NIH 로드맵이 포함되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 연구 자원 센터 또는 NIH의 공식 견해를 대표하지 않습니다.
Materials
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
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