哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

ユビキチンは、76個のアミノ酸^1,2,3の進化的に保存されたタンパク質です。ユビキチンは、活性化(E1)、結合(E2)、およびリガーゼ(E3)酵素を含むカスケードを介して、標的タンパク質上のリジン残基に共有結合します。ユビキチンは最初にE1酵素によって活性化され、次にE2結合酵素に移されます。続いて、E3ユビキチンリガーゼは、ユビキチン負荷E2酵素および基質タンパク質の両方と相互作用し、ユビキチンのC末端と基質1,2,3,4,5中のリジン残基との間のイソペプチド結合の形成を媒介する。ユビキチン化は、ユビキチン部分の基質タンパク質上のリジン残基またはそれ自体への結合を含み、タンパク質モノユビキチン化またはポリユビキチン化をもたらす。このユビキチン化プロセスは真核生物の細胞内で起こり、多種多様な生物学的プロセスを調節します。ユビキチン化は、ユビキチン・プロテアソーム系を介して基質タンパク質の分解をもたらす1,2,3,4,5。さらに、ユビキチン化は、細胞におけるタンパク質細胞内局在、タンパク質複合体形成、およびタンパク質輸送を調節する^3,5。基質タンパク質にライゲーションされたユビキチン部分は、脱ユビキチン化酵素(DUB)によって除去することができる^6,7。特に、ユビキチン鎖が組み立てられるさまざまな方法は、さまざまな生物学的プロセスを調節するための無数の手段を提供します^1,5。基質タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の正確な役割は、これまで完全には理解されていません。ユビキチン化タンパク質の精製は、タンパク質ユビキチン化が様々な細胞プロセスに及ぼす影響の解明に貢献します。

p53タンパク質は最も重要な腫瘍抑制タンパク質の1つであり、ほとんどすべてのヒト癌において遺伝子変異または不活性化を示す8,9,10,11。p53の安定性と活性は、ユビキチン化、リン酸化、アセチル化、メチル化などの翻訳後修飾によってin vivoで微妙に調節されています^12,13。p53タンパク質は、様々な細胞において6分から40分の範囲の短い半減期を有し、これは主にそのポリユビキチン化およびその後のプロテアソーム分解に起因する^10,12。マウスダブルミニッツ2(Mdm2)は、p53のE3ユビキチンリガーゼであり、p53のN末端に結合してその転写活性を阻害する¹²、^14、15。Mdm2は、p53のポリユビキチン化とプロテアソーム分解を促進してその安定性を制御し、p53のモノユビキチン化を誘導して核輸送を促進します^12,14,15,16。ここでは、Mdm2を介したp53ユビキチン化を例に、哺乳動物細胞からユビキチン化タンパク質を精製する方法を詳細に紹介する。標的タンパク質のユビキチン化状態に影響を与える調節因子は、哺乳類細胞で過剰発現またはノックダウン/ノックアウトされた場合に、このin vivoユビキチン化アッセイを使用して同定できます。さらに、ユビキチン化タンパク質は、in vitroデユビキチン化アッセイの基質として使用できます。ハイスループットスクリーニングを実行して、ユビキチン化基質を個々のDUBとインキュベートすることにより、標的タンパク質の特定のDUBを同定できます。ユビキチン化タンパク質は、細胞内の下流のシグナル伝達タンパク質を動員するための足場として機能する可能性があります。ユビキチン化された標的タンパク質複合体は、天然の精製条件下での逐次免疫沈降によって精製し、質量分析によって同定することができる。現在のプロトコルは、ユビキチン化によって調節される細胞タンパク質を調査するために広く使用することができる。

ユビキチン化タンパク質を精製するには、アフィニティータグ付きユビキチン、ユビキチン抗体、ユビキチン結合タンパク質、単離されたユビキチン結合ドメイン(UBD)の使用など、いくつかの方法が確立されています¹⁷。ここでは、アフィニティタグ付きユビキチンをメディエーターとして使用して、哺乳類細胞内のユビキチン化タンパク質を精製するプロトコルを提供します。ポリHisタグ付きユビキチンの使用は、他の方法よりも優れています。ユビキチン化タンパク質は、強力な変性剤の存在下で精製され、細胞タンパク質を線形化し、タンパク質間相互作用を破壊することにより、ニッケル荷電樹脂への非特異的結合を低減します。対照的に、ユビキチン抗体、ユビキチン結合タンパク質、および単離されたUBDをメディエーターとして使用すると、精製はそれほど厳しくない条件下で行う必要があるため、結合パートナーを標的タンパク質から効果的に排除することはできません。さらに、精製は、これらのメディエーターを使用した無関係タンパク質の結合の増加にもつながる可能性があります。さらに、様々なユビキチン結合型ならびにユビキチン結合タンパク質または単離されたUBDによるモノおよびポリユビキチン化に対する結合傾向がある¹⁷。ポリHisタグ付きユビキチンの使用は、すべての細胞ユビキチン化タンパク質を引き下げることに寄与する。あるいは、市販の抗Flagまたは抗HA抗体結合アガロースを使用することで、非変性条件下で大規模なFlagまたはHAタグ付き標的タンパク質の免疫沈降が容易になります。第2の精製工程は、例えば、ポリHisタグ付きユビキチンを標的とするニッケル荷電樹脂によって、ダウンストリーム実験のために高純度でユビキチン化標的タンパク質を取得するために使用することができる。特に、エピトープタグ付け精製戦略は、特異的抗体を取得できない場合に、標的タンパク質を効果的に免疫沈降させることができます。最後に、哺乳動物細胞におけるユビキチン化タンパク質の精製は、インビ トロでの精製と比較して、より生理学的条件下で標的タンパク質のユビキチン結合様式を保持する。