포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

유비퀴틴은 76 개의 아미노산 ^1,2,3의 진화 적으로 보존 된 단백질입니다. 유비퀴틴은 활성화 (E1), 접합 (E2) 및 리가 아제 (E3) 효소를 포함하는 캐스케이드를 통해 표적 단백질의 라이신 잔기에 공유 결합합니다. 유비퀴틴은 먼저 E1 효소에 의해 활성화 된 다음 E2 접합 효소로 옮겨집니다. 이어서, E3 유비퀴틴 리가 아제는 유비퀴틴-로딩 된 E2 효소 및 기질 단백질 모두와 상호 작용하고, 유비퀴틴의 C- 말단과 기질 1,2,3,4,5의 라이신 잔기 사이의 이소 펩티드 결합의 형성을 매개한다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴 잔기를 기질 단백질 상의 라이신 잔기 또는 그 자체에 부착시켜 단백질 모노유비퀴틴화 또는 폴리유비퀴틴화를 유도하는 것을 포함한다. 이 유비퀴틴화 과정은 진핵생물에서 세포 내에서 발생하며 다양한 생물학적 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴-프로테 아좀 시스템 1,2,3,4,5를 통해 기질 단백질의 분해를 초래한다. 또한, 유비퀴틴화는 세포^3,5에서 단백질 세포 내 국소화^, 단백질 복합체 형성 및 단백질 트래피킹을 조절한다. 기질 단백질에 연결된 유비퀴틴 잔기는 데유비퀴틴화 효소(DUB^)에 의해 제거될 수 있습니다^6,7. 특히, 유비퀴틴 사슬이 조립되는 다양한 방법은 다양한 생물학적 과정을 조절하는 무수한 수단을 제공합니다 ^1,5. 기질 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 정확한 역할은 지금까지 불완전하게 이해되고 있습니다. 유비퀴틴화 된 단백질의 정제는 다양한 세포 과정에 대한 단백질 유비퀴틴화의 효과의 해명에 기여한다.

p53 단백질은 가장 중요한 종양 억제 단백질 중 하나이며 거의 모든 인간 암 8,9,10,11에서 유전 적 돌연변이 또는 불 활성화를 나타냅니다. p53 안정성 및 활성은 유비퀴틴화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화^12,13을 포함하는 번역후 변형에 의해 생체내에서 섬세하게 조절된다. p53 단백질은 다양한 세포에서 6 분에서 40 분 범위의 짧은 반감기를 가지며, 이는 주로 폴리 유비 퀴틴 화 및 후속 프로테아좀 분해^10,12로 인해 발생합니다. 마우스 더블분 2 (Mdm2)는 p53의 N 말단에 결합하여 그의 전사 활성^12,14,15를 억제하는 p53의 E3 유비퀴틴 리가제이다. Mdm2는 p53의 폴리유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 촉진하여 안정성을 제어하고 p53의 모노유비퀴틴화를 유도하여 핵 수출^12,14,15,16을 촉진합니다. 여기서, 유비퀴틴화 Mdm2 매개 p53은 포유동물 세포로부터 유비퀴틴화 단백질을 정제하는 방법을 구체적으로 소개하기 위한 예로 사용된다. 표적 단백질의 유비퀴틴화 상태에 영향을 미치는 조절자는 포유류 세포에서 과발현되거나 녹다운/녹아웃될 때 이 생체 내 유비퀴틴화 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 또한, 유비퀴틴화 단백질은 시험관내 탈유비퀴틴화 분석을 위한 기질로서 사용될 수 있다. 유비퀴틴화된 기질을 개별 DUB와 함께 배양하여 표적 단백질에 대한 특정 DUB를 식별하기 위해 고처리량 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 유비퀴틴화된 단백질은 세포에서 다운스트림 신호전달 단백질을 모집하는 스캐폴드로서 작용할 수 있다. 유비퀴틴화된 표적 단백질 복합체는 천연 정제 조건 하에서 순차적 면역침전에 의해 정제될 수 있고 질량 분석법에 의해 확인될 수 있다. 현재 프로토콜은 유비퀴틴화에 의해 조절되는 세포 단백질을 조사하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다.

친화성 태그가 부착된 유비퀴틴, 유비퀴틴 항체, 유비퀴틴 결합 단백질 및 분리된 유비퀴틴 결합 도메인(UBD)의 사용을 포함하는 유비퀴틴화된 단백질을 정제하기 위한 몇 가지 방법이 확립되었습니다¹⁷. 여기에서는 포유동물 세포에서 유비퀴틴화 단백질을 정제하기 위한 매개체로 친화성 태그된 유비퀴틴을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. poly-His-tagged 유비퀴틴의 사용은 다른 방법들에 비해 이점을 제공한다. 유비퀴틴화 단백질은 강력한 변성제의 존재 하에서 정제되며, 이는 세포 단백질을 선형화하고 단백질-단백질 상호 작용을 방해함으로써 니켈 하전 수지에 대한 비특이적 결합을 감소시킵니다. 대조적으로, 유비퀴틴 항체, 유비퀴틴 결합 단백질 및 분리된 UBD를 매개체로 사용하는 것은 덜 엄격한 조건에서 정제를 수행해야 하기 때문에 표적 단백질에서 결합 파트너를 효과적으로 배제할 수 없습니다. 더욱이, 정제는 또한 이들 매개체를 사용하여 관련없는 단백질의 결합 증가를 유도 할 수있다. 또한, 다양한 유비퀴틴 결합 유형뿐만 아니라 유비퀴틴 결합 단백질 또는 단리된 UBDs(¹⁷)에 의한 모노- 및 폴리-유비퀴틴화에 대한 결합 성향이 존재한다. poly-His-tagged 유비퀴틴의 사용은 모든 세포 유비퀴틴화 단백질을 끌어내리는 데 기여합니다. 대안적으로, 시판되는 항-플래그 또는 항-HA 항체-접합된 아가로스의 사용은 비변성 조건 하에서 대규모 플래그- 또는 HA-태그된 표적 단백질을 면역침전시키는 것을 용이하게 한다. 제2 정제 단계는, 예를 들어, 폴리-히스-태그된 유비퀴틴을 표적화하는 니켈-하전된 수지에 의해, 다운스트림 실험을 위해 고순도의 유비퀴틴화된 표적 단백질을 획득하는데 사용될 수 있다. 특히, 에피토프 태깅 정제 전략은 표적 단백질을 효과적으로 면역침전시키기 위해 특정 항체를 획득할 수 없을 때 적응될 수 있다. 마지막으로, 포유류 세포에서 유비퀴틴화 단백질의 정제는 시험관 내 정제와 비교하여 더 많은 생리학적 조건 하에서 표적 단백질의 유비퀴틴 결합 모드를 유지합니다.