Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

L’ubiquitina è una proteina evolutivamente conservata di 76 aminoacidi ^1,2,3. L’ubiquitina lega covalentemente i residui di lisina sulle proteine bersaglio attraverso cascate che coinvolgono gli enzimi attivanti (E1), coniuganti (E2) e ligasi (E3). L’ubiquitina viene prima attivata dall’enzima E1 e quindi trasferita agli enzimi coniuganti E2. Successivamente, le ubiquitina ligasi E3 interagiscono sia con gli enzimi E2 caricati con ubiquitina che con le proteine del substrato e mediano la formazione di un legame isopeptidico tra il C-terminale dell’ubiquitina e un residuo di lisina nel substrato 1,2,3,4,5. L’ubiquitinazione comporta l’attaccamento delle frazioni di ubiquitina ai residui di lisina sulle proteine del substrato o a se stessa, portando alla monoubiquitinazione o alla poliubiquitinazione delle proteine. Questo processo di ubiquitinazione avviene intracellulare negli eucarioti e regola una grande varietà di processi biologici. L’ubiquitinazione provoca la degradazione delle proteine del substrato attraverso il sistema ubiquitina-proteasoma 1,2,3,4,5. Inoltre, l’ubiquitinazione modula la localizzazione subcellulare delle proteine, la formazione di complessi proteici e il traffico proteico nelle cellule ^3,5. Le frazioni di ubiquitina legate alle proteine del substrato possono essere rimosse dagli enzimi deubiquitinanti (DUB)^6,7. In particolare, i diversi modi in cui le catene di ubiquitina sono assemblate forniscono una miriade di mezzi per regolare vari processi biologici ^1,5. I ruoli esatti dell’ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica del substrato rimangono incompletamente compresi fino ad ora. La purificazione delle proteine ubiquitinate contribuisce alla spiegazione degli effetti dell’ubiquitinazione delle proteine su una varietà di processi cellulari.

La proteina p53 è una delle più importanti proteine oncosoppressori e presenta mutazioni genetiche o inattivazione in quasi tutti i tumori umani 8,9,10,11. La stabilità e l’attività di p53 sono delicatamente regolate in vivo da modificazioni post-traduzionali, tra cui ubiquitinazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione^12,13. La proteina p53 ha una breve emivita che va da 6 min a 40 min in varie cellule, che deriva principalmente dalla sua poliubiquitinazione e successiva degradazione proteasomica^10,12. Il doppio minuto 2 del topo (Mdm2) è una ubiquitina ligasi E3 di p53 che si lega al N-terminale di p53 per inibire la sua attività trascrizionale^12,14,15. Mdm2 promuove la poliubiquitinazione e la degradazione proteasomica di p53 per controllarne la stabilità e induce la monoubiquitinazione di p53 per facilitare la sua esportazione nucleare^12,14,15,16. Qui, l’ubiquitinazione di p53 mediata da Mdm2 viene utilizzata come esempio per introdurre in dettaglio un metodo per la purificazione delle proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero. I regolatori che influenzano lo stato di ubiquitinazione delle proteine bersaglio possono essere identificati utilizzando questo test di ubiquitinazione in vivo quando sono sovraespressi o abbattuti / eliminati nelle cellule di mammifero. Inoltre, le proteine ubiquitinate possono essere utilizzate come substrati per il saggio di deubiquitinazione in vitro. È possibile eseguire uno screening ad alto rendimento per identificare DUB specifici per le proteine bersaglio incubando substrati ubiquitinati con singoli DUB. Le proteine ubiquitinate possono agire come un’impalcatura per reclutare proteine di segnalazione a valle nelle cellule. Un complesso proteico bersaglio ubiquitinata può essere purificato mediante immunoprecipitazione sequenziale in condizioni di purificazione native e identificato mediante spettrometria di massa. L’attuale protocollo può essere ampiamente utilizzato per studiare le proteine cellulari regolate dall’ubiquitinazione.

Sono stati stabiliti diversi metodi per purificare le proteine ubiquitinate, che includono l’uso di ubiquitina marcata per affinità, anticorpi ubiquitina, proteine leganti l’ubiquitina e domini isolati leganti l’ubiquitina (UBD)¹⁷. Qui, forniamo un protocollo che utilizza ubiquitina marcata di affinità come mediatore per purificare le proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero. L’uso di ubiquitina poli-His-marcata offre vantaggi rispetto agli altri metodi. Le proteine ubiquitinate vengono purificate in presenza di forti denaturanti, che riducono il legame non specifico alla resina carica di nichel linearizzando le proteine cellulari e interrompendo le interazioni proteina-proteina. Al contrario, l’uso di anticorpi ubiquitina, proteine leganti l’ubiquitina e UBD isolati come mediatori non può escludere efficacemente i partner leganti dalla proteina bersaglio perché la purificazione deve essere eseguita in condizioni meno rigorose. Inoltre, la purificazione può anche portare ad un maggiore legame di proteine non correlate usando questi mediatori. Inoltre, vi è una propensione al legame per vari tipi di legame dell’ubiquitina e per la mono- e poli-ubiquitinazione da parte di proteine leganti l’ubiquitina o UBD isolate¹⁷. L’uso di ubiquitina poli-His-marcata contribuisce ad abbattere tutte le proteine ubiquitinate cellulari. In alternativa, l’uso di agarosio coniugato con anticorpi anti-Flag o anti-HA disponibili in commercio rende più facile immunoprecipitare proteine bersaglio marcate con Flag o HA su larga scala in condizioni non denaturanti. Una seconda fase di purificazione, ad esempio, mediante resina carica di nichel mirata all’ubiquitina poli-His-marcata, può essere utilizzata per acquisire proteine bersaglio ubiquitinate con un’elevata purezza per esperimenti a valle. In particolare, una strategia di purificazione dell’epitopo può essere adattata quando un anticorpo specifico non può essere acquisito per immunoprecipitare efficacemente le proteine bersaglio. Infine, la purificazione delle proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero, rispetto alla purificazione in vitro, mantiene la modalità di legame ubiquitina delle proteine bersaglio in condizioni più fisiologiche.