Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

Ubiquitin ist ein evolutionär konserviertes Protein aus 76 Aminosäuren ^1,2,3. Ubiquitin bindet kovalent Lysinreste an Zielproteine durch Kaskaden mit aktivierenden (E1), konjugierenden (E2) und Ligase (E3) Enzymen. Ubiquitin wird zunächst durch das Enzym E1 aktiviert und dann auf die E2-konjugierenden Enzyme übertragen. Anschließend interagieren E3-Ubiquitin-Ligasen sowohl mit Ubiquitin-beladenen E2-Enzymen als auch mit Substratproteinen und vermitteln die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem C-Terminal von Ubiquitin und einem Lysinrest im Substrat 1,2,3,4,5. Ubiquitinierung beinhaltet die Anlagerung von Ubiquitin-Einheiten an Lysinreste auf Substratproteinen oder an sich selbst, was zu Proteinmonoubiquitinierung oder Polyubiquitinierung führt. Dieser Ubiquitinierungsprozess findet intrazellulär in Eukaryoten statt und reguliert eine Vielzahl biologischer Prozesse. Die Ubiquitinierung führt zum Abbau von Substratproteinen über das Ubiquitin-Proteasom-System 1,2,3,4,5. Darüber hinaus moduliert die Ubiquitinierung die subzelluläre Proteinlokalisation, die Proteinkomplexbildung und den Proteintransport in Zellen ^3,5. Ubiquitin-Einheiten, die an Substratproteine gebunden sind, können durch deubiquitinierende Enzyme (DUBs) entfernt ^werden6,7. Insbesondere bieten die verschiedenen Arten, in denen Ubiquitinketten zusammengesetzt sind, eine Vielzahl von Möglichkeiten, verschiedene biologische Prozesse zu regulieren ^1,5. Die genaue Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Substratproteinfunktion ist bisher unvollständig verstanden. Die Aufreinigung ubiquitinierter Proteine trägt zur Aufklärung der Auswirkungen der Proteinubiquitinierung auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse bei.

Das p53-Protein ist eines der wichtigsten Tumorsuppressorproteine und weist bei fast allen menschlichen Krebserkrankungen genetische Mutationen oder Inaktivierungen auf 8,9,10,11. P53-Stabilität und -Aktivität werden in vivo durch posttranslationale Modifikationen, einschließlich Ubiquitinierung, Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung^12,13, empfindlich reguliert. Das p53-Protein hat eine kurze Halbwertszeit von 6 min bis 40 min in verschiedenen Zellen, die hauptsächlich aus seiner Polyubiquitinierung und dem anschließenden proteasomalen Abbau resultiert^10,12. Maus double minute 2 (Mdm2) ist eine E3-Ubiquitin-Ligase von p53, die an den N-Terminus von p53 bindet, um ihre Transkriptionsaktivität^12,14,15 zu hemmen. Mdm2 fördert die Polyubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von p53, um seine Stabilität zu kontrollieren, und induziert die Monoubiquitinierung von p53, um seinen nuklearen Export zu erleichtern^12,14,15,16. Hier wird am Beispiel der Mdm2-vermittelten p53-Ubiquitinierung eine Methode zur Aufreinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen im Detail vorgestellt. Die Regulatoren, die den Ubiquitinierungsstatus von Zielproteinen beeinflussen, können mit diesem In-vivo-Ubiquitinierungsassay identifiziert werden, wenn sie in Säugetierzellen überexprimiert oder niedergeschlagen/ausgeschaltet werden. Darüber hinaus können ubiquitinierte Proteine als Substrate für In-vitro-Deubiquitinierungstests verwendet werden. Ein Hochdurchsatz-Screening kann durchgeführt werden, um spezifische DUBs für Zielproteine zu identifizieren, indem ubiquitinierte Substrate mit einzelnen DUBs inkubiert werden. Ubiquitinierte Proteine können als Gerüst fungieren, um nachgeschaltete Signalproteine in Zellen zu rekrutieren. Ein ubiquitinierter Zielproteinkomplex kann durch sequentielle Immunpräzipitation unter nativen Reinigungsbedingungen gereinigt und massenspektrometrisch identifiziert werden. Das aktuelle Protokoll kann umfassend verwendet werden, um die zellulären Proteine zu untersuchen, die durch Ubiquitinierung reguliert werden.

Es wurden mehrere Methoden zur Reinigung ubiquitinierter Proteine etabliert, darunter die Verwendung von affinitätsmarkiertem Ubiquitin, Ubiquitin-Antikörpern, Ubiquitin-bindenden Proteinen und isolierten Ubiquitin-bindenden Domänen (UBDs)¹⁷. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das affinitätsmarkiertes Ubiquitin als Mediator verwendet, um ubiquitinierte Proteine in Säugetierzellen zu reinigen. Die Verwendung von poly-His-getaggtem Ubiquitin bietet Vorteile gegenüber den anderen Methoden. Ubiquitinierte Proteine werden in Gegenwart starker Denaturierungsmittel gereinigt, was die unspezifische Bindung an nickelgeladenes Harz reduziert, indem zelluläre Proteine linearisiert und Protein-Protein-Interaktionen gestört werden. Im Gegensatz dazu kann die Verwendung von Ubiquitin-Antikörpern, Ubiquitin-bindenden Proteinen und isolierten UBDs als Mediatoren Bindungspartner nicht effektiv vom Zielprotein ausschließen, da die Reinigung unter weniger strengen Bedingungen durchgeführt werden muss. Darüber hinaus kann die Reinigung auch zu einer erhöhten Bindung von nicht verwandten Proteinen mit diesen Mediatoren führen. Darüber hinaus besteht eine Bindungsneigung für verschiedene Ubiquitin-Verknüpfungstypen sowie Mono- und Polyubiquitinierung durch Ubiquitin-bindende Proteine oder isolierte UBDs¹⁷. Die Verwendung von Poly-His-markiertem Ubiquitin trägt dazu bei, alle zellulären ubiquitinierten Proteine herunterzuziehen. Alternativ erleichtert die Verwendung kommerziell erhältlicher Anti-Flag- oder Anti-HA-Antikörper-konjugierter Agarose die Immunpräzipitation großflächiger Flag- oder HA-markierter Zielproteine unter nicht-denaturierenden Bedingungen. Ein zweiter Reinigungsschritt, beispielsweise durch nickelgeladenes Harz, das auf poly-His-markiertes Ubiquitin abzielt, kann verwendet werden, um ubiquitinierte Zielproteine mit hoher Reinheit für nachgeschaltete Experimente zu gewinnen. Insbesondere kann eine Epitop-Tagging-Reinigungsstrategie angepasst werden, wenn ein spezifischer Antikörper nicht erworben werden kann, um Zielproteine effektiv zu immunpräzipitieren. Schließlich behält die Reinigung ubiquitinierter Proteine in Säugetierzellen im Vergleich zur Reinigung in vitro den Ubiquitin-Bindungsmodus von Zielproteinen unter physiologischeren Bedingungen bei.