Oprensning af allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller

Ubiquitin er et evolutionært konserveret protein af 76 aminosyrer ^1,2,3. Ubiquitin binder kovalent lysinrester på målproteiner gennem kaskader, der involverer aktiverende (E1), konjugerende (E2) og ligase (E3) enzymer. Ubiquitin aktiveres først af E1-enzymet og overføres derefter til E2-konjugerende enzymer. Derefter interagerer E3 ubiquitin-ligaser med både ubiquitinbelastede E2-enzymer og substratproteiner og medierer dannelsen af en isopeptidbinding mellem C-terminalen af ubiquitin og en lysinrest i substratet 1,2,3,4,5. Ubiquitination involverer fastgørelse af ubiquitindele til lysinrester på substratproteiner eller til sig selv, hvilket fører til proteinmonoubiquitination eller polyubiquitination. Denne ubiquitinationsproces forekommer intracellulært i eukaryoter og regulerer en lang række biologiske processer. Ubiquitination resulterer i nedbrydning af substratproteiner via ubiquitin-proteasomsystemet 1,2,3,4,5. Derudover modulerer ubiquitination protein subcellulær lokalisering, proteinkompleksdannelse og proteinhandel i celler ^3,5. Ubiquitindele, der er ligeret med substratproteiner, kan fjernes ved hjælp af deubiquitinerende enzymer (DUB’er)^6,7. Især giver de forskellige måder, hvorpå ubiquitinkæder samles, et utal af midler til at regulere forskellige biologiske processer ^1,5. De nøjagtige roller af ubiquitination i regulering af substratproteinfunktion forbliver ufuldstændigt forstået indtil nu. Oprensningen af ubiquitinerede proteiner bidrager til belysningen af virkningerne af protein ubiquitination på en række cellulære processer.

P53-proteinet er et af de vigtigste tumorundertrykkende proteiner og udviser genetiske mutationer eller inaktivering i næsten alle humane kræftformer 8,9,10,11. P53 stabilitet og aktivitet reguleres delikat in vivo ved posttranslationelle modifikationer, herunder ubiquitination, phosphorylering, acetylering og methylering^12,13. P53-proteinet har en kort halveringstid på mellem 6 min og 40 min i forskellige celler, hvilket hovedsageligt skyldes dets polyubiquitination og efterfølgende proteasomal nedbrydning^10,12. Mus dobbelt minut 2 (Mdm2) er en E3 ubiquitin ligase af p53, der binder til N-terminalen af p53 for at hæmme dens transkriptionelle aktivitet^12,14,15. Mdm2 fremmer polyubiquitination og proteasomal nedbrydning af p53 for at kontrollere dens stabilitet og inducerer monoubiquitination af p53 for at lette sin nukleare eksport^12,14,15,16. Her bruges Mdm2-medieret p53 ubiquitination som et eksempel til at introducere en metode til oprensning af allestedsnærværende proteiner fra pattedyrceller i detaljer. De regulatorer, der påvirker ubiquitinationsstatus for målproteiner, kan identificeres ved hjælp af dette in vivo ubiquitination assay, når de overudtrykkes eller slås ned / slås ud i pattedyrceller. Derudover kan ubiquitinerede proteiner anvendes som substrater til in vitro deubiquitination assay. En screening med høj kapacitet kan udføres for at identificere specifikke DUB’er for målproteiner ved at inkubere allestedsnærværende substrater med individuelle DUB’er. Ubiquitinerede proteiner kan fungere som et stillads for at rekruttere nedstrøms signalproteiner i celler. Et allestedsnærværende målproteinkompleks kan oprenses ved sekventiel immunoprecipitation under native oprensningsbetingelser og identificeres ved massespektrometri. Den nuværende protokol kan i vid udstrækning bruges til at undersøge de cellulære proteiner reguleret af ubiquitination.

Flere metoder er blevet etableret til at rense ubiquitinerede proteiner, som omfatter brugen af affinitetsmærkede ubiquitin, ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerede ubiquitinbindende domæner (UBD’er)¹⁷. Her leverer vi en protokol, der bruger affinitetsmærket ubiquitin som mediator til at rense allestedsnærværende proteiner i pattedyrceller. Brugen af poly-his-tagged ubiquitin giver fordele i forhold til de andre metoder. Ubiquitinerede proteiner oprenses i nærvær af stærke denatureringsmidler, hvilket reducerer ikke-specifik binding til nikkelladet harpiks ved linearisering af cellulære proteiner og forstyrrende protein-proteininteraktioner. I modsætning hertil kan brugen af ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerede UBD’er som mediatorer ikke effektivt udelukke bindende partnere fra målprotein, fordi oprensning skal udføres under mindre strenge betingelser. Desuden kan oprensning også føre til øget binding af ikke-relaterede proteiner ved anvendelse af disse mediatorer. Derudover er der en bindingstilbøjelighed til forskellige ubiquitinbindingstyper samt mono- og poly-ubiquitination ved ubiquitinbindende proteiner eller isolerede UBD’er¹⁷. Brugen af poly-his-tagged ubiquitin bidrager til at trække ned alle cellubiquitinerede proteiner. Alternativt gør brugen af kommercielt tilgængelig anti-Flag eller anti-HA antistofkonjugeret agarose det lettere at immunprecipitate store flag- eller HA-mærkede målproteiner under ikke-denaturerende forhold. Et andet oprensningstrin, for eksempel ved nikkelladet harpiks rettet mod poly-his-mærket ubiquitin, kan bruges til at erhverve ubiquitinerede målproteiner med en høj renhed til downstream-eksperimenter. Især kan en epitopmærkningsrensningsstrategi tilpasses, når et specifikt antistof ikke kan erhverves effektivt til immunoprecipitate målproteiner. Endelig bevarer oprensning af allestedsnærværende proteiner i pattedyrceller sammenlignet med oprensning in vitro ubiquitinbindingstilstanden for målproteiner under mere fysiologiske forhold.