تنقية بروتينات p53 في كل مكان من خلايا الثدييات

Ubiquitin هو بروتين محفوظ تطوريا من 76 من الأحماض الأمينية¹،^2،3. يوبيكويتين يربط تساهميا بقايا ليسين على البروتينات المستهدفة من خلال الشلالات التي تنطوي على تنشيط (E1) ، واقتران (E2) ، وإنزيمات ligase (E3). يتم تنشيط Ubiquitin أولا بواسطة إنزيم E1 ثم يتم نقله إلى إنزيمات الاقتران E2. بعد ذلك ، تتفاعل أربطة يوبيكويتين E3 مع كل من إنزيمات E2 المحملة باليوبيكويتين وبروتينات الركيزة وتتوسط في تكوين رابطة إيزوببتيد بين الطرف C من يوبيكويتين وبقايا ليسين في الركيزة¹،²،³،^4،5. يتضمن الوجود في كل مكان ربط شقوق ubiquitin ببقايا اللايسين على بروتينات الركيزة أو على نفسها ، مما يؤدي إلى أحادي البروتين أو تعدد البيئات. تحدث عملية الانتشار هذه داخل الخلايا في حقيقيات النوى وتنظم مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية. يؤدي الوجود في كل مكان إلى تدهور بروتينات الركيزة عبر نظام يوبيكويتين بروتيازوم¹،²،³،^4،5. بالإضافة إلى ذلك ، يعدل الانتشار في كل مكان توطين البروتين تحت الخلوي ، وتكوين مركب البروتين ، والاتجار بالبروتين في الخلايا ^3,5. يمكن إزالة شقوق Ubiquitin المرتبطة ببروتينات الركيزة عن طريق إنزيمات deubiquitinating (DUBs)^6,7. والجدير بالذكر أن الطرق المختلفة التي يتم بها تجميع سلاسل ubiquitin توفر عددا لا يحصى من الوسائل لتنظيم العمليات البيولوجية المختلفة ^1,5. لا تزال الأدوار الدقيقة للانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة بروتين الركيزة غير مفهومة بشكل كامل حتى الآن. يساهم تنقية البروتينات في كل مكان في توضيح آثار انتشار البروتين في كل مكان على مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية.

يعد بروتين p53 أحد أهم البروتينات المثبطة للورم ويظهر طفرات جينية أو تعطيلا في جميع أنواع السرطان البشرية تقريبا⁸،⁹،^10،11. يتم تنظيم استقرار ونشاط P53 بدقة في الجسم الحي من خلال تعديلات ما بعد الترجمة ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، والفسفرة ، والأستيل ، والمثيلة^12،13. يحتوي بروتين p53 على عمر نصف قصير يتراوح من 6 دقائق إلى 40 دقيقة في خلايا مختلفة ، والذي ينتج بشكل رئيسي عن تعدد الجزيئات والتحلل البروتيني اللاحق^10,12. الماوس المزدوج الدقيقة 2 (Mdm2) هو E3 ubiquitin ligase من p53 الذي يرتبط بنهاية N من p53 لمنع نشاطه النسخي¹²،^14،15. يعزز Mdm2 تعدد البائن والتدهور البروتيني ل p53 للتحكم في استقراره ويحث على تعدد p53 لتسهيل تصديره النووي¹²،¹⁴،^15،16. هنا ، يتم استخدام انتشار p53 بوساطة Mdm2 كمثال لتقديم طريقة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان من خلايا الثدييات بالتفصيل. يمكن تحديد المنظمين الذين يؤثرون على حالة انتشار البروتينات المستهدفة في كل مكان باستخدام مقايسة الانتشار في الجسم الحي عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط أو هدمها / إخراجها في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام البروتينات في كل مكان كركائز لمقايسة deubiquitination في المختبر. يمكن إجراء فحص عالي الإنتاجية لتحديد DUBs محددة للبروتينات المستهدفة عن طريق احتضان ركائز موجودة في كل مكان مع DUBs الفردية. قد تعمل البروتينات الموجودة في كل مكان كسقالة لتجنيد بروتينات الإشارات في الخلايا. يمكن تنقية مركب البروتين المستهدف في كل مكان عن طريق الترسيب المناعي المتسلسل في ظل ظروف التنقية الأصلية وتحديده بواسطة قياس الطيف الكتلي. يمكن استخدام البروتوكول الحالي على نطاق واسع للتحقيق في البروتينات الخلوية التي ينظمها الوجود في كل مكان.

تم إنشاء عدة طرق لتنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان ، والتي تشمل استخدام يوبيكويتين الموسومة بالتقارب ، والأجسام المضادة لليوبيكويتين ، والبروتينات المرتبطة باليوبيكويتين ، والمجالات المعزولة المرتبطة باليوبيكويتين (UBDs)¹⁷. هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام يوبيكويتين الموسوم بالتقارب كوسيط لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات. يوفر استخدام ubiquitin ذو العلامات المتعددة مزايا على الطرق الأخرى. يتم تنقية البروتينات في كل مكان في وجود مسخ قوي ، مما يقلل من الارتباط غير المحدد بالراتنج المشحون بالنيكل عن طريق خطي البروتينات الخلوية وتعطيل تفاعلات البروتين والبروتين. في المقابل ، فإن استخدام الأجسام المضادة لليوبيكويتين ، والبروتينات المرتبطة باليوبيكويتين ، و UBDs المعزولة كوسطاء لا يمكن أن يستبعد بشكل فعال شركاء الربط من البروتين المستهدف لأن التنقية تحتاج إلى إجراء في ظل ظروف أقل صرامة. علاوة على ذلك ، قد تؤدي التنقية أيضا إلى زيادة ارتباط البروتينات غير ذات الصلة باستخدام هذه الوسطاء. بالإضافة إلى ذلك ، هناك ميل ملزم لأنواع ربط ubiquitin المختلفة بالإضافة إلى أحادي ومتعدد الوجود بواسطة بروتينات ملزمة لليوبيكويتين أو UBDs^{المعزولة 17}. يساهم استخدام ubiquitin ذو العلامات المتعددة في سحب جميع البروتينات الخلوية في كل مكان. بدلا من ذلك ، فإن استخدام الأغاروز المقترن بالأجسام المضادة للعلم أو الأجسام المضادة لحمض الهيمونيك المتاح تجاريا يجعل من السهل ترسيب البروتينات المستهدفة واسعة النطاق التي تحمل علامة العلم أو HA في ظل ظروف غير مسخة. يمكن استخدام خطوة تنقية ثانية ، على سبيل المثال ، عن طريق راتنج مشحون بالنيكل يستهدف يوبيكويتين بولي هيس ، للحصول على بروتينات مستهدفة في كل مكان ذات نقاوة عالية للتجارب النهائية. والجدير بالذكر أنه يمكن تكييف استراتيجية تنقية علامات الخاتمة عندما لا يمكن الحصول على جسم مضاد معين لترسيب البروتينات المستهدفة بشكل فعال. أخيرا ، فإن تنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات ، مقارنة بالتنقية في المختبر ، تحتفظ بوضع ربط ubiquitin للبروتينات المستهدفة في ظل ظروف فسيولوجية أكثر.