Saccharina latissima Embriyosunda Hedefe Yönelik Lazer Ablasyonu
Summary
Embriyodaki spesifik hücrelerin yok edilmesi, hücre kaderinde yer alan hücresel etkileşimleri incelemek için güçlü bir araçtır. Mevcut protokol, kahverengi alg Saccharina latissima’nın erken embriyosundaki hedeflenen hücrelerin lazer ablasyonu için teknikleri açıklamaktadır.
Abstract
Saccharina latissima’da embriyo, lamina veya bıçak adı verilen tek katmanlı bir hücre tabakası olarak gelişir. Her embriyo hücresinin gözlemlenmesi kolaydır, komşularından kolayca ayırt edilebilir ve ayrı ayrı hedeflenebilir. Onlarca yıldır, lazer ablasyon embriyo gelişimini incelemek için kullanılmıştır. Burada, kahverengi alg S. latissima’nın erken embriyoları için hücreye özgü lazer ablasyon için bir protokol geliştirilmiştir. Sunulan çalışma şunları içerir: (1) kültür koşulları da dahil olmak üzere kritik parametrelerin bir açıklaması ile Saccharina embriyolarının hazırlanması, (2) lazer ablasyon ayarları ve (3) ışınlanmış embriyonun sonraki büyümesinin hızlandırılmış mikroskopi kullanılarak izlenmesi. Ek olarak, embriyoların görüntüleme platformundan laboratuvara geri taşınması için en uygun koşullar hakkında ayrıntılar sağlanır ve bu da sonraki embriyo gelişimini derinden etkileyebilir. Laminariales takımına ait algler, Saccharina’ya benzer embriyogenez kalıpları gösterir; Bu protokol, bu taksondaki diğer türlere kolayca aktarılabilir.
Introduction
Lazer ablasyon, embriyo gelişimini incelemek için onlarca yıldır kullanılmaktadır. Embriyo hücrelerinin bir lazer ışını ile ışınlanması, embriyogenez sırasında rejeneratif potansiyeli ve hücre soyunun modifikasyonunu izlemeyi ve hedeflenen ablasyonun hücre bölünmesi ve hücre kaderi üzerindeki etkisini araştırmayı mümkün kılar. Lazer ablasyon yöntemlerinde kullanılan model organizmalar tipik olarak böcekler1,2, nematodlar3,4, omurgalılar5,6 ve bazen debitkiler 7,8 gibi hayvanlardır. Ek olarak, 1994 ve 1998 yıllarında kahverengi alg Fucus üzerinde bir lazer mikro-ablasyon yaklaşımı, hücre duvarının erken embriyonun fotopolarizasyonundaki rolünü göstermek için kullanılmıştır 9,10.
Kahverengi algler, 1.6 milyar yıl önce ökaryotik ağacın kökünde ayrılan Stramenopiles grubuna aittir. Sonuç olarak, hayvanlar ve bitkiler gibi diğer çok hücreli organizmalardan filogenetik olarak bağımsızdırlar11. Saccharina latissima, daha yaygın olarak yosun olarak bilinen Laminariales takımına aittir ve dünyadaki en büyük organizmalar arasındadır, 30 m’nin üzerindeki boyutlara ulaşırlar. Saccharina sp., gıda ve yem gibi birçok uygulama için kullanılan büyük bir deniz yosunudur ve polisakkaritleri dünya çapında tarım, farmakolojik ve kozmetik endüstrilerinde kullanılmak üzere ekstrakte edilir12, 13. Özellikle Asya’da ve daha yakın zamanda Avrupa’da yetiştirilmesi, yavruları açık denizde serbest bırakmadan önce kuluçkahanelerde embriyoların hazırlanmasını gerektirir. Tüm kelpler gibi, bir haploid gametofitin büyüdüğü ve döllenme için gametler ürettiği mikroskobik bir gametofitik fazdan oluşan bifazik bir yaşam döngüsüne ve büyük bir düzlemsel bıçağın deniz tabanına veya kayalara tutturulmuş tutucusundan geliştiği diploid makroskopik bir sporofitik faza sahiptir. Sporofit, olgunlukta haploid sporları serbest bırakır, böylece yaşam döngüsü14,15,16’yı tamamlar.
S. latissima bazı ilginç morfolojik özellikler sunar17. Embriyosu, farklı doku tiplerinin ortaya çıkmasıyla çakışan çok katmanlı bir yapı elde etmeden önce tek katmanlı bir düzlemsel tabaka15,18,19 olarak gelişir. Ek olarak, Laminariales, embriyoları maternal gametofitik dokularına bağlı kalan kahverengi alglerin tek taksonlarından biridir (Desmarestiales ve Sporochnales de15). Bu özellik, maternal dokunun bu gelişimsel süreçteki rolünü inceleme ve kahverengi alglerdeki maternal kontrol mekanizmalarını hayvanlardaki ve bitkilerdeki mekanizmalarla karşılaştırma fırsatı sunar.
Bu makalede, erken bir kelp embriyosunda lazer ablasyon için ilk tam protokol sunulmaktadır. UV ns-pulsed tekniğini içeren bu protokol, embriyogenez sırasında kendi rollerini incelemek için bireysel embriyo hücrelerinin spesifik yıkımına neden olur. Prosedür, Laminariales’te embriyogenez sırasında hücre etkileşimlerini ve hücre kaderini araştırmak için güvenilir bir yaklaşım sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lokal hücresel lazer ablasyon, yüksek hassasiyetle zamansal ve mekansal ablasyona izin verir. Bununla birlikte, etkinliği hedef hücrelerin erişilememesi nedeniyle engellenebilir; örneğin, tüm hücreler üç boyutlu bir embriyoya aittir. Bu protokol, tüm hücrelerin bir lazer ışını ile ayrı ayrı kolayca ayırt edilebileceği ve yok edilebileceği tek katmanlı bir lamina geliştiren alg Saccharina latissima’nın embriyosu üzerinde geliştirilmiştir.
Lazer güc?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SB’nin doktora hibesi, Bretagne Bölgesi (ARED hibe numarası COH20020) ve Sorbonne Université tarafından finanse edilmektedir. I.T.is doktora hibesi, Bretagne Bölgesi (ARED hibe numarası COH18020) ve Norvegian NMBU Üniversitesi tarafından finanse edilmektedir. Bu proje, MITI disiplinlerarası programları aracılığıyla CNRS’den finansal destek almıştır. MRic, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-10-INBS-04) tarafından desteklenen ulusal altyapı France-BioImaging üyesidir.
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. . The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology – Established and Emerging. , 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).
- Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
