כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.
לאיזון Redox יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס תאי. הדור המוגבר של מינים חמצן תגובתי (ROS) מקדם את השינוי של חלבונים, שומנים, ו- DNA, אשר בסופו של דבר עשוי להוביל לשינוי בתפקוד התאים ומוות התא. לכן, זה מועיל לתאים כדי להגדיל את ההגנה נוגדת החמצון שלהם בתגובה על עלבונות מזיקים, או על ידי הפעלת מסלול נוגד חמצון כמו Keap1 / Nrf2 או על ידי שיפור אוכלי נבלות redox (ויטמינים A, C, ו- E, β קרוטן, פוליפנולים, בין היתר). דלקת ומתח חמצוני מעורבים בפתוגנזה ובהתקדמות של רטינופתיות, כגון רטינופתיה סוכרתית (DR) ורטינופתיה של פגות (ROP). מאז תאי גליה מולר (MGCs) לשחק תפקיד מפתח הומאוסטזיס של רקמת רשתית עצבית, הם נחשבים מודל אידיאלי ללמוד מנגנוני הגנה תאיים אלה. במובן זה, כימות רמות ROS עם שיטה לשחזור ופשוט הוא חיוני כדי להעריך את התרומה של מסלולים או מולקולות המשתתפים במנגנון ההגנה על תאים נוגדי חמצון. במאמר זה, אנו מספקים תיאור מלא של ההליכים הנדרשים למדידת ROS עם DCFH-DA בדיקה וציטומטריית זרימה ב- MGCs. שלבי מפתח לעיבוד נתונים cytometry זרימה עם התוכנה מסופקים כאן, כך הקוראים יוכלו למדוד רמות ROS (אמצעים גיאומטריים של FITC) ולנתח היסטוגרמה פלואורסצנטית. כלים אלה מועילים מאוד כדי להעריך לא רק את הגידול ROS לאחר עלבון תאי, אלא גם כדי ללמוד את ההשפעה נוגדת החמצון של מולקולות מסוימות שיכולות לספק אפקט מגן על התאים.
הרשתית העצבית היא רקמה מאורגנת מאוד המציגה שכבות עצביות מוגדרות היטב. באלה, נוירונים (גנגליון, amacrine, דו קוטבי, אופקי, ותאי photoreceptor) מחוברים זה לזה וגם עם תאי גליה מולר (MGCs) ואסטרוציטים, מה שמוביל פוטו-טרנסדוקציה נאותה ועיבוד של מידע חזותי 1,2. MGCs ידועים יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס רשתית כי הם חוצים את כל קטע הרשתית, ולכן, הם יכולים לקיים אינטראקציה עם כל סוגי התאים כי לווסת תהליכי הגנה מרובים. דווח כי MGCs יש מספר פונקציות חשובות לשמירה והישרדות של נוירונים ברשתית, כולל גליקוליזה כדי לספק אנרגיה נוירונים, הסרת פסולת עצבית, מיחזור של נוירוטרנסמיטורים, ושחרור של גורמים נוירוטרופיים, בין היתר 3,4,5.
מצד שני, דלקת, עקה חמצונית וניטרוסיבית מעורבים בפתוגנזה ובהתקדמות של מחלות אנושיות רבות, כולל רטינופתיות 6,7,8,8,9,10,11. מאזן redox בתאים תלוי רגולציה הדוקה של רמות ROS. ROS נוצרים כל הזמן בתנאים פיזיולוגיים כתוצאה של נשימה אירובית בעיקר. החברים העיקריים במשפחת ROS כוללים רדיקלים חופשיים תגובתיים כגון אניון סופראוקסיד (O2͘͘͘͘•−), רדיקלים הידרוקסיל (•OH), מי חמצן שונים (ROOR′), הידרופרוקסידים (ROOH), ומי חמצן ללא רדיקלי (H2O2)12,13. בשנים האחרונות, התברר כי ROS ממלא תפקיד איתות חשוב בתאים על ידי שליטה בתהליכים חיוניים. MGCs יש הגנה נוגדת חמצון חזקה על ידי הפעלת גורם גרעיני תמלול אריתרויד-2 הקשורים גורם גורם 2 (Nrf2) ואת הביטוי הבא של חלבונים נוגדי חמצון כדי לחסל את הייצור המופרז של ROS בתנאים פתולוגיים 14,15,16. כאשר התאים מאבדים את שיווי המשקל שלהם עקב ייצור מוגזם של ROS או יכולת פגומה להסיר ROS, הצטברות של עקה חמצונית מקדמת שינויים מזיקים בחלבונים, שומנים, ו- DNA, המובילים ללחץ תאי או למוות. הגידול של מערכת ההגנה נוגדת החמצון ברשתית משפר את הרזולוציה ומניעה של רטינופתיות, כגון ROP ו RD 17,18,19,20,20,21,22,23,24. לכן, המדידה של ייצור ROS בזמן אמת היא כלי רב עוצמה ושימושי.
ישנן מספר שיטות למדידת ייצור ROS או עקה חמצונית בתאים. בין אלה, 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) בדיקה היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר לכימות ישיר של מצב redox של תא 25,26,27,28. בדיקה זו היא ליפופילית ולא פלואורסצנטית. דיפוזיה של בדיקה זו על פני קרום התא מאפשרת את המחשוף שלה על ידי אסטראזות תאיות בשני קשרים אסתר, לייצר מוצר קוטבי יחסית קרום התא אטום, 2 ′,7′-dichlorofluorescein (H2DCF). מולקולה לא פלואורסצנטית זו מצטברת באופן תאי, והחמצון שלאחר מכן על ידי ROS מניב את DCF המוצר הפלואורסצנטי ביותר. החמצון של הגשושית הוא תוצר של פעולה של סוגים מרובים של ROS (peroxynitrite, רדיקלים הידרוקסיל, תחמוצת החנקן, או מי חמצן), אשר ניתן לזהות על ידי cytometry זרימה או מיקרוסקופיה קונפוקלי (פליטה ב 530 ננומטר עירור ב 485 ננומטר). המגבלה של טכניקה זו היא כי סופראוקסיד ומי חמצן אינם מגיבים בעוצמה עם H2DCF25,29. במאמר זה, אנו משתמשים בדיקה DCFH-DA כדי למדוד ולכמת ROS על ידי cytometry זרימה. מסיבה זו, אנו גורמים לייצור ROS על ידי גירוי MGCs עם ממריץ ROS, A או B, לפני טעינת התאים עם בדיקה פלואורסצנטית. בנוסף, אנו משתמשים בתרכובת נוגדת חמצון. לבסוף, אנו מציגים נתונים מייצגים ואמינים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה.
מספר מצבים פתולוגיים, כגון סרטן, מחלות דלקתיות, איסכמיה/רפרטפוזיה, מחלות לב איסכמיות, סוכרת ורטינופתיות, וגם מצבים פיזיולוגיים כמו הזדקנות, מובילים לייצור יתרשל ROS 6,7,8,9,10,111. לכן, אי?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות למריה פילאר קרספו ופאולה אלחנדרה עבאדי מ- CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, קורדובה, ארגנטינה) על הסיוע בציטומטריית זרימה וגבריאלה פורלן ונוליה מלדונאדו לסיוע בתרבות התא. אנו מודים גם לויקטור דיאז (פרו-מזכיר התקשורת המוסדית של FCQ) על הפקת הווידאו והעריכה.
מאמר זה מומן על ידי מענקים מ Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), and Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).
2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
Cell Culture Dishes 100×20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
Cryovial | CRYO.S – Greiner Bio-One | 126263 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
Glucose | Merck | 108337 | |
hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon – Corning | BD-352008 | |
Sodium Azide | Merck | 822335 | |
Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
Trypan Blue | Merck | 111732 | |
Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |